副猪嗜血杆菌Cpx双组份系统潜在诱导因子和基因yccA功能的初步探究

摘要

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）是引起猪格拉瑟氏病的病原，一种应激环境条件下侵入体内，导致宿主出现如胸膜炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎为病症的传染病。双组份调节系统(TCS，two-component regulatory system)是细菌产生环境应答并调节基因差异表达的膜应激系统(ESRs，Envelope stress responses)。Cpx双组份系统是副猪嗜血杆菌膜应激系统之一，由组氨酸激酶CpxA和反应调节子CpxR组成。应激环境诱导Cpx系统激活，CpxR通过改变基因的转录水平缓解膜压力。本课题拟通过对副猪嗜血杆菌进入宿主体内面临的环境分析，初步探究副猪嗜血杆菌Cpx系统潜在诱导因子及特定因子激活下Cpx系统调控基因的功能。
　　主要成果如下:
　　1.高渗透压、重金属和抗生素可能是Cpx双组份系统的潜在诱导因子
　　副猪嗜血杆菌定殖猪上呼吸道，感染宿主过程中面临环境不断变化，如温度、渗透压、pH和抗生素等。实验通过模拟副猪嗜血杆菌感染过程中的环境变化，采用荧光定量检测双组份系统基因cpxA和cpxR的转录表达，探索副猪嗜血杆菌Cpx双组份系统基因转录情况。结果发现:副猪嗜血杆菌JS0135Cpx双组份系统的基因cpxA和cpxR在高渗透压(KCl)，重金属（铜离子、铁离子）和抗生素类（庆大霉素、红霉素）作用下转录上调。如庆大霉素刺激时基因cpxA转录上调7倍，基因cpxR转录上调12倍;铜离子诱导时基因cpxA转录上调10倍，基因cpxR转录上调35倍。表明上述环境因素可能是副猪嗜血杆菌Cpx双组份系统潜在诱导因子。
　　2.铜离子诱导下副猪嗜血杆菌JS0135基因yccA和secY转录上调
　　铜离子刺激下，副猪嗜血杆菌Cpx双组份系统基因转录水平上调极显著，那副猪嗜血杆菌JS0135内膜相关基因的转录情况怎样？我们通过荧光定量检测副猪嗜血杆菌JS0135内膜相关基因转录情况。结果发现:0.5mM Cu2+刺激下，副猪嗜血杆菌JS0135基因yccA转录上调4倍和secY转录上调2～3倍，差异显著。表明铜离子诱导副猪嗜血杆菌内膜相关基因转录水平上调，基因yccA和secY可能与副猪嗜血杆菌膜铜离子应激有一定作用。
　　3.CpxR蛋白结合基因yccA启动子区域
　　根据以上荧光定量结果，我们推测铜离子刺激下，副猪嗜血杆菌Cpx双组份系统蛋白CpxR可能调控膜铜离子应激相关基因。为验证这个猜测，我们通过荧光定量检测基因cpxR缺失副猪嗜血杆菌内膜相关基因转录情况。同时将CpxR蛋白原核表达纯化后，采取EMSA实验探究蛋白CpxR结合的哪些基因的启动子区域。荧光定量结果:编码通道蛋白tolC转录上调15～16倍，差异极显著，基因yccA转录下调0.5～1倍，差异显著。EMSA实验结果:蛋白CpxR结合编码内膜蛋白的基因yccA启动子区域，推测CpxR蛋白可能调控基因yccA应答庆大霉素的刺激。
　　4.构建基因yccA的缺失和互补菌株，初步探究基因yccA的功能
　　首先，以SH0165全基因组为模板设计引物和扩增PCR，构建重组质粒pK18mobsacB-yccA-UKD，通过自然转化筛选出基因yccA缺失株。
　　在pH6.5，pH7.5和pH8.5的条件下培养JS0135和JS0135ΔyccA，绘制生长曲线，并探究生物被膜形成情况。结果发现缺失基因yccA后JS0135菌株在弱碱条件下生长缓慢，生物被膜形成能力减弱，表明基因yccA对弱碱条件敏感，可能影响细菌生物被膜形成。JS0135和JS0135ΔyccA铜敏感实验发现，JS0135ΔyccA在0～0.5mM Cu2+环境下生长受到抑制，同时荧光定量实验结果显示基因yccA的转录水平上调显著，表明基因yccA可能跟副猪嗜血杆菌铜耐受作用有关。
　　综上，本研究发现高渗透压、重金属和抗生素可能是Cpx双组份系统的潜在诱导因子，蛋白CpxR调控基因yccA可能跟副猪嗜血杆菌铜耐受作用有关。

目录

声明

摘要

缩略词表(Abbreviation)

1．文献综述

1．1 副猪嗜血杆菌研究进展

1．1．1 副猪嗜血杆菌病概述

1．1．2 副猪嗜血杆菌生存环境及Cpx系统

1．2 细菌生存环境及Cpx系统研究进展

1．2．1 有毒代谢物质

1．2．2 抗生素

1．2．3 宿主环境

1．2．4 Cpx系统诱导因子

1．2．5 Cpx系统结构及调控基因

1．2．6 Cpx系统与碱性pH

1．2．7 Cpx系统与生物被膜形成

1．2．8 Cpx系统与铜稳态

1．3 基因yccA研究进展

2．研究目的与意义

3．1 实验材料

3．1．1 菌株和质粒载体

3．1．2 基本培养基和抗生素

3．1．3 酶类和试剂盒

3．1．4 凝胶电泳相关试剂和溶液

3．1．5 蛋白纯化相关溶液

3．1．6 主要仪器

3．1．7 引物

3．2 实验方法

3．2．1 副猪嗜血杆菌复苏和培养

3．2．2 副猪嗜血杆菌基因组DNA的提取

3．2．3 荧光定量

3．2．4 电泳迁移率实验(EMSA)

3．2．5 yccA缺失重组质粒的构建

3．2．5 自然转化筛选基因缺失株JS0135ΔyccA∷kan

3．2．6 yccA缺失株PCR鉴定

3．2．7 C-yccA互补质粒构建

3．2．8 缺失株JS0135ΔyccA∷kan生物学研究

4．结果与分析

4．1 温度对Cpx双组份系统的影响

4．2 氯化钾对Cpx双组份系统的影响

4．3 庆大霉素对Cpx双组份系统的影响

4．4 红霉素对Cpx双组份系统的影响

4．5 低浓度铁对Cpx双组份系统的影响

4．6 低浓度铜对Cpx双组份系统影响

4．7 乙醇／丙酮对Cpx双组份系统影响

4．8 低浓度铜刺激下内膜相关基因荧光定量

4．9 电泳迁移率实验(EMSA)结果

4．9．1 蛋白CpxR结合序列分析

4．9．2 蛋白CpxR表达纯化

4．9．3 蛋白CpxR与基因启动子结合

4．10 重组自杀质粒的构建

4．11 缺失株JS0135ΔyccA∷kan的鉴定

4．12．1 不同pH条件下生长情况

4．12．2 生物被膜形成实验

4．12．3 铜敏感实验

5．讨论

5．1 Cpx系统激活的诱导因子

5．2 基因yccA功能研究

5．3 Cpx调控基因yccA对副猪嗜血杆菌铜耐受的可能性机制

5．4 Cpx调控基因yccA后续研究展望

6．结论

参考文献

附录

致谢