牛支原体强弱菌株分泌蛋白的分离和初步鉴定研究

摘要

牛支原体是导致牛支原体病的病原体，主要引起牛呼吸综合征、关节炎及奶牛乳腺炎等多种疾病。病原分泌蛋白直接参与病原体和宿主的信息交流，是病原体发挥致病和免疫作用的重要组分，可望作为药物和疫苗的潜在靶标。然而牛支原体分泌蛋白研究刚刚起步，已鉴定的分泌蛋白很少，其在致病与免疫中的作用有待研究。本研究基于蛋白质组学技术以及生物信息学分析，寻找牛支原体强弱菌株具有功能的分泌蛋白，为牛支原体致病机制研究奠定基础。取得如下结果:
　　1.以牛支原体强毒株HB0801和其传代150代的弱毒株为研究对象，通过摸索适合的无血清培养基，建立牛支原体分泌蛋白的提取方法，利用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（2-D）和非标记定量蛋白质组学(Label-Free)分离、鉴定并量化牛支原体强弱菌株分泌蛋白的表达情况，对8个分泌蛋白的生物学功能进行了初步分析。利用蛋白质组学质谱分析，共鉴定牛支原体分泌蛋白548个，有效的分泌蛋白477个，理论分子量介于10kDa-90kDa。其中较牛支原体弱毒株P150，牛支原体强毒株P1上调的分泌蛋白有66个，下调的分泌蛋白有48个;46个分泌蛋白只在P1中鉴定到，5个分泌蛋白只在P150中鉴定到。
　　对鉴定出的牛支原体强弱菌株分泌蛋白进行KEGG通路分析和GO富集分析，发现牛支原体强毒株P1的分泌蛋白较弱毒株P150在以下蛋白质富集度具有显著性差异:生物过程(Biological Process)中，核糖核蛋白复合物的生物合成(Ribonucleoprotein Complex Biogenesis)、核糖体合成(Ribosome Biogenesis)、细胞对DNA损伤反应（Cellular Response to DNA Damage Stimulus）、DNA修复(DNA Repair)、细胞成分生物合成(Cellular Component Biogenesis)和细胞应激反应(Cellular Response to Stress);在细胞组分(Cellular Component)中，胞内核糖核蛋白复合物（Intracellular Ribonucleoprotein Complex）和核糖核蛋白复合物(Ribonucleoprotein Complex);在分子功能(Molecular Function)中，结构分子活性（Structural Molecule Activity）和组成核糖体结构(Structural Constituent of Ribosome)。牛支原体弱毒株P150分泌蛋白受到显著性影响的通路为核糖体(Ribosome)和磷酸转移酶系统(Phosphotransferase System)。通过亚细胞定位和分泌类型预测，发现有15个分泌蛋白定位于外膜(Outer Membrane)，2个分泌蛋白在胞外(Extracellular);65个分泌蛋白是非经典型(Non-classical)分泌类型，而有53个分泌蛋白是经典型(Classical)分泌类型。
　　2.选取了8个的分泌蛋白MbovP103(PDHB)、MbovP145、MbovP174、MbovP339(VspY1)、MbovP481(EF-Tu)、MbovP676(EF-G)、MbovP725、MbovP796作为研究对象，对这些分泌蛋白进行克隆表达、多克隆抗体血清的制备，并验证了它们的免疫原性。另外，在探究分泌蛋白炎性反应的功能中，发现分泌蛋白rMbovP339蛋白能够促进牛巨噬细胞BoMac的炎性反应。利用本实验室前期构建的牛支原体转座子突变体库筛选得到rMbovP339的突变菌株，在感染比为1000的条件下刺激牛巨噬细胞BoMac12h后，发现其促炎因子IL-1β和IL-6mRNA表达水平显著降低;同时，将去除内毒素的rMbovP339蛋白(10μg)刺激BoMac12h后，促炎因子IL-1β和IL-6mRNA表达水平显著升高，IL-1β和IL-6证明了Mbov-0339基因表达的蛋白具有促进炎性反应的作用。
　　综上所述，本研究应用非标记定量蛋白质组学(Label-Free)方法对牛支原体强弱菌株的分泌蛋白质组进行分离和鉴定，初步揭示了牛支原体强弱菌株分泌蛋白组及其差异蛋白。对8种分泌蛋白进行原核表达和多克隆抗体制备及生物功能探究，发现重组蛋白rMbovP339对牛巨噬细胞BoMac的炎性反应具有促进作用。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略语表

第1章 文献综述

1．1 牛支原体病研究进展

1．1．1 病原学

1．1．2 牛支原体致病机制

1．1．3 牛支原体毒力因子

1．1．4 牛支原体病诊断

1．2 支原体分泌蛋白及分泌蛋白质组研究进展

1．2．1 支原体分泌蛋白及分泌蛋白质组

1．2．2 支原体分泌蛋白的分泌方式

1．2．3 支原体分泌蛋白的研究方法

1．3 本研究的目的与意义

第2章 牛支原体强弱菌株分泌蛋白的分离鉴定及功能研究

2．1 前言

2．2 实验材料

2．2．1 菌株、细胞

2．2．2 主要实验仪器

2．2．3 主要试剂与试剂盒

2．2．4 主要溶液及配制方法

2．2．5 实验动物

2．2．6 引物设计与合成

2．3 实验方法

2．3．1 牛支原体强弱菌株的培养及无血清培养条件的摸索

2．3．2 牛支原体分泌蛋白样品的制备

2．3．3 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)及质谱鉴定

2．3．4 非标记定量蛋白质组学(Label-free)分离鉴定强弱菌株差异分泌蛋白

2．3．5 牛支原体强弱菌株分泌蛋白的克隆及原核表达

2．3．6 牛支原体分泌蛋白及突变株诱导牛巨噬细胞BoMac炎性反应

2．4 结果与分析

2．4．1 牛支原体强弱菌株的鉴定

2．4．2 牛支原体分泌蛋白提取方法的建立

2．4．3 牛支原体分泌蛋白样品的含量测定

2．4．4 牛支原体分泌蛋白的分离鉴定

2．4．5 牛支原体强弱菌株分泌蛋白的生物信息学分析

2．4．6 牛支原体强弱菌株分泌蛋白的验证

2．4．7 牛支原体分泌蛋白及突变株感染牛巨噬细胞的炎性反应

2．5 讨论

2．5．1 关于牛支原体强弱菌株分泌蛋白提取条件

2．5．2 关于非标记定量蛋白组学(Label-free)鉴定分泌蛋白方法

2．5．3 牛支原体分泌蛋白rMbovP339感染巨噬细胞的炎性反应

2．5．4 关于分离鉴定的牛支原体分泌蛋白

结论

附录

参考文献

致谢