柑橘果肉色泽的遗传研究及类胡萝卜素含量的QTL定位

摘要

柑橘果肉中含有丰富的类胡萝卜素，其种类和含量不仅影响果实外观品质，也影响着柑橘果实的营养价值和保健功能。作为多年生木本植物，其受到童期长、多胚性等的限制，目前关于柑橘果肉色泽的遗传机理分析以及柑橘果肉中营养物质类胡萝卜素含量和种类的QTL研究都很少。
　　本课题组10多年前以红橘为母本，枳壳为父本，经胚抢救和分子标记鉴定获得红橘（C.reticulata）×枳壳（Poncirus trifoliata）杂交F1群体，而且该群体已构建好高密度遗传图谱，为后续的遗传研究和QTL定位奠定了基础。本研究通过对杂交群体果肉进行色差值测定和高效液相色谱分析，初步探索柑橘果肉色泽差异形成的生理基础以及柑橘果肉遗传特征，并利用高密度遗传连锁图谱对类胡萝卜素进行代谢QTL分析，得到了一些与色泽或类胡萝卜素性状较关联的遗传位点。主要研究结果如下:
　　1、红橘×枳壳杂交群体果肉色泽多样性形成的生理基础及其遗传特征分析
　　通过对红橘(C.reticulata)×枳壳（Poncirus trifoliata）杂交F1群体进行果肉色差值测量，发现群体子代的果肉色泽属于数量性状。对红橘、枳壳及79份杂交子代果肉进行高效液相色谱分析，发现不同类胡萝卜素间含量差异很大，同一色素在不同子代中差异也较大。对所检测到的类胡萝卜素及总类胡萝卜素含量进行正态检验，发现所有色素均为正态或偏正态分布，即每一种色素的调控都受到多个基因的控制。
　　利用色差值与不同类胡萝卜素和总类胡萝卜素含量进行相关分析，发现异堇黄质、叶黄素、玉米黄质、β-隐黄质、未知-3、未知-4这6种色素与色差值表现为正相关关系;总类胡萝卜素含量与色差值也为正相关。根据色差值与各类胡萝卜素在总类胡萝卜素中所占比例相关分析发现，玉米黄质、未知-4、叶黄素占比与色差值为正相关，八氢番茄红素、六氢番茄红素占比与色差值为负相关。
　　对类胡萝卜素代谢途径基因进行表达分析，结果显示DXS、IPI基因在两个极端池间有显著性差异，这两个基因参与类胡萝卜素前体物质GGPP的合成。PSY、LCYB1、HYD基因在深色果肉中表达水平高于浅色果肉。
　　2、QTL分析
　　本研究共检测到8个类胡萝卜素的QTLs，分布在5条染色体上。在检测到的QTL位点中，有7种类胡萝卜素及总类胡萝卜素均定位在2号染色体的同一区间，3号和9号染色体也有定位区间重叠的现象，表明有共同的遗传因子决定多种类胡萝卜素的含量差异。
　　根据基因表达结果，本实验共找到不同极端表型池间差异表达的7个基因，并且这些基因都在前面的遗传定位的区间中。通过进一步对这7个基因进行发育时期表达模式验证，从中筛选出2个与色泽高度相关的候选基因，其基因编号分别为:Ciclev10019730m、Ciclev10021268m。
　　对Ciclev10019730m、Ciclev10021268m基因启动子区、编码区进行克隆。在红橘中，Ciclev10019730m基因编码区存在等位多态性现象，其中一条等位基因从ATG开始第1475个碱基处有14bp缺失，而另一条等位基因在此处无缺失。枳壳两个等位基因均无碱基缺失。基因Ciclev10021268m启动子区在枳壳中存在等位多态性现象，其中一条等位基因在-1842bp到-1686bp之间有一段156bp缺失，在-1373bp到-737bp之间有一段636bp的插入，另一条等位基因无缺失，且序列基本与红橘一致。

目录

声明

摘要

缩略词表

1．前言

1．1 课题的提出

1．2 前人研究进展

1．2．1 柑橘果实品质研究进展

1．2．2 柑橘类胡萝卜素研究进展

1．2．3 柑橘分子育种研究进展

1．3 本研究的目的和内容

2．材料与方法

2．1 植物材料

2．2 实验方法

2．2．1 果肉色差值测定

2．2．2 柑橘果肉类胡萝卜素分析

2．2．3 标准曲线的制作

2．2．4 DNA的提取

2．2．5 RNA提取与cDNA制备

2．2．6 实时荧光定量PCR

2．2．7 QTL定位

2．2．8 候选区间关联验证

2．2．9 候选基因预测

2．2．10 候选基因序列分析

2．2．11 数据处理

3．结果与分析

3．1 红橘×枳壳杂交群体果肉色泽差异形成的生理基础

3．1．1 红橘、枳壳果肉色泽差异分析

3．1．2 红橘×枳壳杂交群体果肉色泽分析

3．1．3 色差值、色素含量、各色素所占比例相关分析

3．1．4 类胡萝卜素代谢途径基因表达分析

3．2 QTL分析

3．2．1 类胡萝卜素及总类胡萝卜素含量正态检验

3．2．2 QTL定位

3．2．3 候选区间标记关联验证

3．3 候选基因筛选

3．3．1 候选基因预测

3．3．2 候选基因表达分析

3．4 候选基因克隆和序列分析

3．4．2 Ciclev10019730m基因编码区序列分析

3．4．3 Ciclev10021268m基因启动子序列分析

3．4．4 Ciclev10021268m基因编码区序列分析

4．讨论

4．1 红橘×枳壳杂交群体果肉色泽差异形成的机制

4．2 类胡萝卜素QTL定位及候选基因验证分析

5．问题与展望

参考文献

附录

致谢