声明
摘要
缩略词表
1．前言
1．1研究问题的由来
1．2文献综述
1．2．1猪链球菌病概述
1．2．2猪链球菌与STSLS
1．2．3炎性小体
1．3研究目的与意义
2．实验材料和方法
2．1本研究所用试剂
2．2引物
2．3其它常用试剂
2．4菌株
2．5实验小鼠
2．6主要试剂配制方法
2．7细胞或改造细胞系培养方法
2．8本研究所涉菌株或突变体培养方法
2．9构建nlrp3缺失细胞系具体步骤
2．9．1构建Lenti-V2-mN3质粒
2．9．2转染293T细胞，获得慢病毒粒子
2．9．3 J774a．1感染慢病毒并获得单细胞克隆
2．9．4挑选和筛选NLRP3表达缺失的细胞系
2．9．5 NLRP3表达缺失的细胞系鉴定
2．10构建msly(P353L)突变菌株及生物学特性鉴定
2．10．1突变株msly(P353L)-SC-19的构建策略
2．10．2质粒构建
2．10．3溶血素部分基因含溶血活性关键位点的缺失突变体的构建
2．10．4溶血素溶血活性突变体的构建
2．10．5猪链球菌2型溶血素溶血活性突变株msly(P353L)生物学特性分析
2．11溶血素蛋白的纯化
2．12小鼠感染与不同抑制剂处理实验
2．13在293T细胞中重构炎性小体
2．14炎性小体激活检测实验
2．14．3不同抑制剂抑制SC-19感染THP1细胞NLRP3炎性小体激活实验
2．14．4鉴定猪链球菌激活炎性小体的组分
2．14．5重组溶血素蛋白激活炎性小体
2．14．6胆固醇剂量依赖抑制炎性小体激活实验
2．14．7 Δsly溶血素回补菌株和P1／7的过表达菌株激活炎性小体
2．15统计分析
3．结果与分析
3．1．1．小鼠NLRP3细胞系的构建
3．1．2．msly(P353L)溶血活性突变体的构建
3．1．3．溶血素蛋白的纯化
3．2炎性小体激活诱导炎性因子“风暴”促进STSLS
3．2．2 Caspase-1的抑制剂明显缓解SC-19感染所致STSLS相关症状
3．2．3阻断IL-18能缓解链球菌引起的STSLS的症状
3．3 NLRP3炎性小体的激活促进猪链球菌所致STSLS
3．3．2 SC-19引起炎性小体激活依赖钾离子外流
3．3．3 NLRP3是SC-19引起炎性小体激活所必需
3．3．4 NLRP3特异性的抑制剂能抑制SC-19引起的炎性小体的激活
3．3．5 NLRP3特异性的抑制剂能缓解SC-19感染小鼠引起的STSLS
3．4猪链球菌是通过溶血素的溶血活性激活NLRP3炎性小体
3．4．1溶血活性是SC-19激活炎性小体所必需
3．4．2溶血素蛋白可以直接激活炎性小体
3．4．4 SC-19引起的炎性小体激活后诱导细胞ASC“speck”的形成以及与NLRP3的共定位
3．5猪链球菌激活炎性小体是STSLS发生的重要原因
3．5．1溶血活性突变株msly(P353L)诱发STSLS的比例显著降低
3．5．2溶血活性突变株msly(P353L)有开发成为弱毒疫苗的可能性
3．6流行毒株SC-19所致的STSLS与溶血素高表达相关
3．6．1不同菌株中溶血素表达及激活炎性小体程度差异
3．6．2溶血素回补菌株及P1／7溶血素过表达菌株的构建
3．6．3溶血素回复菌株Δsly+Csly毒力恢复
3．6．4 P1／7菌株过表达溶血素后毒力显著提高
3．6．5 P1／7菌株过表达溶血素后促进小鼠组织损伤的发生
4．讨论
4．1揭示猪链球菌激活NLRP3炎性小体与STSLS之间的关系
4．1．1溶血素与细胞焦亡
4．1．2炎性小体特异性抑制剂降低机体的过度炎症反应及应用前景
4．1．3对NLRP3炎性小体激活的第一信号的探讨
4．1．4溶血素溶血活性突变菌株成为弱毒活疫苗的可能性
4．2本研究存在的问题
4．2．1溶血素表达调控机制仍待解析
4．2．2 NLRP3和AIM2炎性小体激活差异
4．2．3对于炎性小体激活后的下游效应探讨不够充分
4．3结论
参考文献
个人资料
发表论文
致谢
