瘦素促进人肝癌细胞增殖、侵袭和抗凋亡作用及其作用机制的初步研究

摘要

背景与目的：
　　 最近的流行病学研究发现肥胖与原发性肝细胞性肝癌的关系密切，而肥胖人群体内血清的瘦素水平增高，作为一种调节能量代谢的脂肪因子，瘦素也有生长因子的作用，但其与肝癌的关系报道不多。本研究拟首先观察瘦素及其受体在原发性肝细胞性肝癌组织中的表达情况，接着观察瘦素对人肝癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响并初步探讨其可能的机制，为瘦素可能作为一种重要的生长因子参与了肝癌的发生发展提供理论依据。
　　 方法：
　　 (1)瘦素及其受体在人肝癌组织中表达情况的研究：采用免疫组织化学染色法检测28例原发性肝细胞性肝癌及其对应的癌旁组织中瘦素和瘦素受体蛋白的表达,并就其表达与临床病理组织学参数之间的关系进行分析。
　　 (2)瘦素对人肝癌细胞增殖活性的研究：以人肝癌细胞Huh 7为研究对象，在培养液中加入不同浓度的瘦素后，采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞周期，实时荧光定量PCR和Western blot 法检测细胞周期调控蛋白CyclinD1和P21 waf1的表达。
　　 (3)瘦素对阿霉素诱导人肝癌细胞凋亡的影响：用阿霉素作为凋亡诱导剂预处理Huh 7 细胞3h 后，在培养液中加入浓度为100ng/ml的瘦素，24h 后提取细胞DNA电泳检测DNA ladder，Hochest33258 荧光染色观察细胞凋亡的形态学变化，流式细胞仪检测细胞的凋亡率，实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因Bax和Bcl-2的表达情况。
　　 (4)瘦素对人肝癌细胞体外侵袭、迁移能力的影响：用细胞划痕迁移实验和细胞侵袭重建基底膜实验观察测瘦素(100 ng/ml)作用24 h 后对Huh 7 细胞迁移力和侵袭力的影响，并用实时荧光定量PCR分析瘦素对基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMP)mRNA的影响。
　　 结果：
　　 (1)瘦素在肝癌组织和癌旁组织中的阳性率分别为82.14[％]和35.71[％]，瘦素受体在肝癌组织和癌旁组织中的阳性率分别为78.57[％]和42.68[％]，瘦素及其受体在肝癌组织中的阳性率都高于癌旁组织，差别具有显著性差异(P<0.01)。瘦素及其受体的表达与患者年龄、性别、HbsAg 阳性、抗-HCV 抗体阳性、伴有肝硬化与否、肿瘤大小、肿瘤分期和组织学分级均无相关性，其差异无统计学意义(P>0.05),但瘦素及其受体的高低表达与肿瘤是否发生血管侵犯有关，发生血管侵犯的肿瘤的瘦素及其受体的表达率均高于未发生血管侵犯的肿瘤，其差别具有统计学意义(P<0.05)。
　　 (2)通过生长曲线可以发现，处理组的细胞数明显高于对照组，而且随着瘦素浓度的增加，细胞数也增加，有一定的剂量依耐性；MTT 法检测细胞增殖显示瘦素可以促进Huh 7 细胞的增殖，有一定的时间和剂量依耐性；流式细胞仪检测结果显示瘦素能明显降低G0/G1 期细胞比例并提高S 期细胞比例，细胞凋亡率也有明显降低；
　　 实时荧光定量PCR和Western blot 法检测显示瘦素(100ng/ml)处理24h 后，CyclinD1mRNA和蛋白的表达明显增高，P21 waf1 mRNA和蛋白的表达明显降低，其差别具有统计学意义(P<0.01)。
　　 (3)瘦素能够抑制阿霉素诱导的人肝癌细胞凋亡，与对照组相比，瘦素处理组的DNA ladder 条带明显减弱，Hochest33258 荧光染色也发现瘦素处理组的凋亡细胞明显减少，流式细胞仪检测发现对照组的凋亡率是(47.77±2.90)[％]，而瘦素处理组的凋亡率是(30.17±2.03)[％]，明显下降(P<0.01)，实时荧光定量PCR检测发现Bcl-2 mRNA表达量增高至对照组的2.31 倍，Bax mRNA 表达量减弱至对照组的0.46 倍，差异均有统计学意义(P<0.05)。
　　 (4)瘦素(100ng/ml)处理24h 后，与对照组细胞相比，瘦素处理组的细胞迁移运动能力明显增强，细胞穿透聚碳酸酯膜的能力也显著增强(41.80±3.19 对18.20±2.86，P<0.01)；实时荧光定量PCR检测发现MMP-2和MMP-9 mRNA 表达量分别增高至对照组的4.25和2.73 倍(P 均<0.01)。
　　 结论：
　　 本研究发现瘦素及其受体在肝癌组织中存在着高表达现象，发生血管侵犯的肿瘤的瘦素及其受体的表达率均高于未发生血管侵犯的肿瘤；用外源性瘦素直接干预人肝癌细胞系Huh 7 细胞，能明显影响肿瘤细胞周期，促进肿瘤细胞的增殖，其机制可能是通过促进Cyclin D1 表达、抑制P21 waf1 表达，使肿瘤细胞由G0/G1 期向S 期转换，进而促进其增殖；瘦素也可以抑制阿霉素诱导的人肝癌细胞凋亡，可能是通过上调抗凋亡因子Bcl-2的表达及抑制促凋亡因子Bax的表达来实现其抗凋亡作用；瘦素还可以明显的提高人肝癌细胞迁移力和侵袭力，其提高其侵袭力的作用机制可能与MMP水平的增高有关。总之，瘦素可能作为一种重要的生长因子参与了肝癌的发生发展。