氮酮促进脂质体介导质粒DNA转染兔角膜内皮细胞的实验研究

摘要

目的: 研究水溶性氮酮对体外培养的兔眼角膜内皮细胞活性及超微结构的影响，探索水溶性氮酮的眼部安全应用浓度；观察阳离子脂质体Lipofectamine TM 2000是否能介导目的基因转移至兔角膜内皮细胞，优化阳离子脂质体转染CECS的条件；探讨氮酮（AZONE）促进脂质体介导质粒DNA转染兔角膜内皮细胞的作用，观察氮酮对于脂质体转染的影响，探索提高脂质体转染效率的方法。
　　 方法: 体外培养兔眼角膜内皮细胞，采用MTT法、扫描和透射电子显微镜研究不同浓度水溶性氮酮对细胞活性和超微结构的影响；采用细胞培养方法，以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因，通过体外细胞转染实验，用不同的细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间优化转染条件，荧光显微镜观察目的基因的表达；配制不同转染试剂，脂质体联合pEGFP-N1、氮酮联合脂质体及pEGFP-N1、氮酮联合pEGFP-N1、单纯pEGFP-N1、单纯脂质体、单纯氮酮，分别处理兔角膜内皮细胞，流式细胞仪及荧光显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白的表达，计算并比较转染效率。
　　 结果: 浓度0.1g.L-1以下的水溶性氮酮作用24h对角膜内皮细胞的活性没有明显影响，浓度0.5g.L-1以上的水溶性氮酮作用24h，可以引起角膜内皮细胞活性下降(P<0.01）。在浓度0.1 g.L-1以下水溶性氮酮作用10min，扫描电子显微镜可以观察到角膜内皮细胞膜的裂隙形成，而对细胞器等结构无明显损害，浓度0.5 g.L-1及以上的水溶性氮酮可导致细胞器肿胀甚至细胞死亡；角膜内皮细胞内可见脂质体介导的绿色荧光蛋白表达，Lipofectamine TM 在细胞融合度为80%～90%，脂质体/DNA 为3μl/μg，脂质体的量为1.8μl，转染时间为5 h时，转染效率最高；脂质体转染CECS 前以0.1g.L-1 氮酮孵育5min，转染效率最高，单纯氮酮、单纯脂质体及对照组处理的细胞不表达绿色荧光蛋白，氮酮联合脂质体及pEGFP-N1对兔角膜内皮细胞的转染效率为42.6%；脂质体联合pEGFP2N1组的转染效率为21.4%；氮酮联合pEGFP-N1组的转染效率为7.2%。单纯质粒组的转染效率为1%，氮酮加脂质体加PEGFP-N1组转染效率高于其他转染组(P<0.01)。
　　 结论: 水溶性氮酮在浓度0.1g.L-1可以使角膜内皮细胞膜产生裂隙，而不会导致细胞活性的降低；阳离子脂质体可有效介导目的基因转移至角膜内皮细胞内，GFP可作为报告基因优化脂质体转染条件。氮酮可促进脂质体介导质粒DNA转染兔角膜内皮细胞，在有效的转染浓度下对细胞无明显毒性，有望成为促进角膜内皮细胞基因转染的新型试剂。