PCR-SSP方法研究武汉人群HLA-A*02多态性及其常见亚型基因的克隆

摘要

HLA-A*02不同亚型在提呈抗原肽及T细胞识别方面的功能差异一直是研究的热点，而且在临床器官移植过程中HLA-A*02亚型不匹配引起的强烈的同种反应也越来越受到重视。因此在肿瘤免疫学方法治疗、同种反应研究中常需要对HLA-A*02亚型及其功能加以分析。
　　 为了进一步研究HLA-A*02不同亚型在提呈抗原肽及T细胞识别方面的功能，我们建立了一种通过19条引物组成的15对特异引物组合，能够快速检测出17个HLA-A*02亚型巢式聚合酶链反应-序列特异性引物（PCR-SSP）HLA-A*02等位基因分型方法，并调查了该等位基因在武汉人群的分布情况。同时在检测亚型的基础上克隆了HLA-A*0206基因及构建了HLA-A*0207真核表达载体，本研究主要内容如下：
　　 目的：①建立一种能简易、快速检测出HLA-A*02亚型分型方法及调查武汉地区人群该等位基因的分布；②克隆HLA-A*0206基因，并构建HLA-A*0207真核表达载体。
　　 方法：①本研究从武汉健康志愿者献血人员中经第一轮PCR筛选HLA-A*02阳性个体，然后通过具有较高特异性第二轮PCR-SSP进行HLA-A*02亚型等位基因分析。此外，由于A*0209和A*0215N的多态性位点在第四外显子，第一轮PCR即可进行亚型分型，不需两轮PCR分型。②为了验证我们方法的可靠性，采用T2细胞（A*0201）作为阳性对照，取部分标本用抗HLA-A*02特异性单抗BB7.2进行血清学流式细胞（FACS）检测，并送PCR产物进行测序。③根据亚型分型结果，采用RT-PCR方法克隆HLA-A*0206基因，并构建HLA-A*0207真核表达载体，挑取单克隆细菌进行扩增，提取质粒酶切、测序鉴定。
　　 结果：①从154例武汉健康志愿者献血人员中经第一轮PCR筛选78例HLA-A*02阳性个体，血清学FACS检测检测结果也都为阳性；②从HLA-A*02阳性个体中共检测到5个A*02等位基因，其中A*0201基因频率最高（15.7%）；其余依次为A*0207 (5.8%)，A*0206 (4.7%)，A*0203 (2.6%)，A*0210(0.7%)；亚型特异性PCR-SSP分型的结果与测序分析结果也完全一致；③克隆的HLA-A*0206基因及构建的HLA-A*0207真核表达载体，分别挑单克隆测序结果均与Genebank提供序列一致，说明HLA-A*0206基因克隆及HLA-A*0207真核表达载体构建成功。
　　 结论：我们成功地建立了一种能简易快速地检测出占有A*02频率99%以上17种亚型的巢式PCR-SSP分型方法，通过该方法检测到武汉地区HLA-A*02分布具有高度多态性,其中A*0201基因频率最高（15.7%）；其余依次为A*0207 (5.8%)，A*0206 (4.7%)，A*0203 (2.6%)，A*0210(0.7%)。在分型的基础上克隆了包含两端部分非编码区（UTR）的HLA-A*0206等位基因及成功构建了HLA-A*0207真核表达载体，为进一步研究HLA-A*02各亚型功能差异及T细胞识别同种反应奠定了基础。