重组2型腺相关病毒介导锰超氧化物歧化酶高表达对耳蜗血管纹缘细胞氧化损伤保护作用的研究

摘要

本研究分为三部分： 第一部分、耳蜗血管纹缘细胞氧化性损伤体外模型的建立 目的: 建立耳蜗血管纹缘细胞(Marginal cells，MCs)氧化性损伤的体外模型。 方法: 体外培养的耳蜗血管纹缘细胞中加入不同浓度的过氧化氢(Hydrogen peroxide，H2O2)，观察细胞形态结构变化；采用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法检测200、300、400、600、800umol/L H2O2作用0.5、1、2、4、16、24h对血管纹缘细胞活性的影响；检测不同浓度H2O2作用2h血管纹缘细胞脂质过氧化产物丙二醛(Malondial—dehyde，MDA)含量的变化；应用碘化丙锭(Propidium Iodide，PI)染色流式细胞仪测定细胞的凋亡率；采用免疫印迹法（Western blot）检测凋亡因子Caspase-3活化片段Cleaved-caspase-3的表达。 结果: H2O2作用后血管纹缘细胞出现核固缩、边缘化,胞浆浓缩,被膜包裹,隆起,产生凋亡；随着H2O2浓度的增加、H2O2作用时间的延长，缘细胞活性降低；200umol/L的H2O2作用2h，即可诱导缘细胞凋亡率升高,差异有统计学意义(P<0.05)；Cleaved-caspase-3在正常缘细胞呈微弱表达，H2O2作用后Cleaved-caspase-3表达明显增强，并随H2O2浓度的增高而增强，600umol/L组表达开始减弱，800umol/L仅见弱表达。 结论: H2O2可复制耳蜗血管纹缘细胞的氧化性损伤，成功建立缘细胞氧化性损伤的体外模型，Caspase-3的激活参与了缘细胞的氧化损伤过程。 第二部分、重组2型腺相关病毒介导锰超氧化物歧化酶转染大鼠耳蜗血管纹缘细胞的研究 目的:　探讨以重组2型腺相关病毒(Recombinant adeno-associated viruses of the serotypes 2，rAAV2)为载体转染体外培养的大鼠耳蜗血管纹缘细胞（Marginal cells，MCs），获得高表达锰超氧化物歧化酶（Manganese Superoxide Dismutase，MnSOD）转基因缘细胞的可行性。 方法:　实验组按感染复数(MOI)为104v.g./cell对体外培养的血管纹缘细胞转染rAAV2- MnSOD-EGFP，同时设转染rAAV2-EGFP的缘细胞作为空载对照组，未转染细胞为空白对照组。荧光显微镜下每2d观察1次MCs的绿色荧光蛋白（Enhenced green fluorescent protein，EGFP）表达情况。比色法测定各组MCs的MnSOD活性。激光共聚焦显微镜下观察转染rAAV2- MnSOD-EGFP后MnSOD的表达，免疫印迹法（Western blot）半定量分析MnSOD的表达水平。 结果:　(1) 各组MCs转染后，生长正常。空载对照组MCs转染rAAV2-EGFP后2天开始出现微弱EGFP的表达，1周后至高峰；实验组转染rAAV2-MnSOD-EGFP后4d出现EGFP的表达，10d至高峰；且持续细胞体外生长的整个周期。EGFP的表达在荧光显微镜490nm波长激发光下呈黄绿色，弥漫于整个胞质。(2)根据激光共聚焦显微镜及Western blot检测结果、经过计算，实验组较空载对照组和空白对照组的MCs中MnSOD的表达明显升高,差异有统计学意义。 结论:　rAAV2-MnSOD-EGFP能有效地转染体外培养的MCs并持续高表达MnSOD。 第三部分、重组2型腺相关病毒介导锰超氧化物歧化酶高表达对耳蜗血管纹缘细胞氧化损伤的保护作用 目的:　探讨以重组2型腺相关病毒（Recombinant adeno-associated viruses of the serotypes 2，AAV2)介导锰超氧化物歧化酶（Manganese superoxide dismutase，MnSOD)高表达对耳蜗血管纹缘细胞氧化损伤的作用及机制。 方法:　体外培养血管纹缘细胞，分为实验组、对照组及正常组。实验组按感染复数(MOI)为104v.g./cell转染rAAV2-MnSOD-EGFP，同时转染rAAV2-EGFP作对照组及不作处理缘细胞为正常组。荧光显微镜下观察MCs绿色荧光蛋白（Enhenced green fluorescent protein，EGFP）的表达情况及免疫印迹法（Western blot）分析转染后MnSOD的表达水平。实验组及对照组同时暴露于400umol/L过氧化氢(Hydrogen peroxide H2O2) 2h，24h后比色法测定各组丙二醛（Malondialdehyde，MDA)含量；流式细胞PI荧光标记检测细胞凋亡率；Western blot检测凋亡因子caspase-3活化片段Cleaved caspase-3的表达。 结果:(1) 各组MCs转染后,生长正常,实验组转染rAAV2-MnSOD-EGFP后4d出现EGFP的表达，10d至高峰；且持续细胞体外生长的整个周期。实验组MnSOD的表达及活性明显高与对照组及正常组,差异有显著性(P<0.05)。(2) 经过氧化氢作用后实验组MDA、caspase-3活化片段Cleaved caspase-3的表达及凋亡率明显低与对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。 结论:　rAAV2介导MCs高表达MnSOD对MCs氧化损伤有保护作用，这种保护作用与抑制凋亡因子caspase-3的活化有关。