CD4/CD8T细胞分型及T-bet/GATA3基因表达与1型糖尿病相关性研究

摘要

第一部分STZ诱导小鼠1型糖尿病模型CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群变化及分析 目的：研究STZ诱导小鼠1型糖尿病（T1DM）模型中CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群变化情况，为1型糖尿病发病机制研究提供理论依据。 方法:40mg/kg链脲佐菌素（STZ）连续5d腹腔注射制备小鼠1型糖尿病模型。FACS检测小鼠脾脏CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+CD25+T细胞阳性率，MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖反应，ELISA检测血清细胞因子IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ含量，HE染色检测小鼠胰腺病理改变。 结果:末次注射STZ后2wk，糖尿病模型小鼠脾脏CD4+T、CD8+T细胞比例均明显减少（P<0.05），CD4+/CD8+比值增加，CD4+CD25+T细胞数量下降，但与正常小鼠比较，两者均无统计学差异（P>0.05）。4wk时，糖尿病模型小鼠脾脏CD4+T细胞数量和CD4+/CD8+比值明显高于正常小鼠（P<0.05，P<0.01），CD8+T细胞和CD4+CD25+T细胞数量明显低于正常小鼠（P<0.01），差异具有统计学意义。MTT检测显示，糖尿病模型小鼠脾淋巴细胞增殖能力在末次STZ后2wk和4wk均见明显增强（P<0.05）。ELISA检测显示，血清细胞因子IFN-γ含量在STZ模型2wk组和4wk组均明显高于正常对照组（P<0.05，P<0.01），而IL-2、IL-4和IL-10水平在各组间无显著差异。HE染色镜检发现，STZ模型2wk组小鼠胰腺中可见明显炎性细胞浸润，胰岛结构尚完整；而出现显性高血糖的STZ模型4wk组小鼠胰岛内见大量炎性细胞浸润，胰岛结构严重破坏。 结论:1型糖尿病发病过程始终存在淋巴细胞亚群失衡，CD4+Th1细胞异常激活和CD8+T细胞缺陷在1型糖尿病病理改变中起重要作用。 第二部分致病性CD4+T细胞在诱导1型糖尿病发病中的作用研究 目的:过继转移纯化的致糖尿病性CD4+T细胞，探讨致病性CD4+T细胞在诱导1型糖尿病（T1DM）发病中的作用。 方法:小剂量链脲佐菌素（STZ，40mg/kg）连续5次腹腔注射（ip）制备1型糖尿病（T1DM）小鼠模型。4wk后处死发病小鼠，取脾制备细胞悬液，IL-2刺激培养7d后收集致糖尿病性脾细胞，并制备纯化的致病性CD4+T细胞。致糖尿病性脾细胞和纯化的致病性CD4+T细胞分别经尾静脉注射（iv）过继转移到STZ2次预处理的BALB/c小鼠体内，常规观察4wk。FACS检测致糖尿病性脾细胞表型，MTT法检测细胞增殖活性，ELISA检测细胞因子（IL-2、IFN-g、IL-4、IL-10）含量，HE染色检测胰腺病理改变。 结果:3×106致糖尿病性脾细胞过继转移成功诱导受者小鼠糖尿病发病，而等量纯化的致病性CD4+T细胞过继转移却不能引起受者小鼠血糖升高。FACS检测显示致糖尿病性脾细胞中T细胞占85.6％，CD4+T细胞占81.7％。MTT检测显示致糖尿病性脾细胞和纯化的致病性CD4+T细胞均具有高的淋巴细胞增殖活性（P<0.05），脾细胞过继组小鼠脾淋巴细胞增殖能力显著增强（P<0.05），而CD4+T细胞过继组小鼠脾淋巴细胞增殖活性与正常对照组比较没有明显差异（P>0.05）。ELISA检测发现，致糖尿病性脾细胞和纯化的致病性CD4+T细胞上清液中均含有高浓度的IL-2和IFN-γ，与正常脾细胞比较差异具有显著性（P<0.05）；脾细胞过继组小鼠血清中IFN-γ浓度明显升高（P<0.01），IL-2、IL-4和IL-10水平无明显改变；CD4+T细胞过继组小鼠血清各细胞因子含量均与正常对照组相似，差异无统计学意义（P>0.05）。HE检查发现，脾细胞过继组小鼠胰岛内见大量淋巴细胞浸润和严重胰岛β细胞损害，CD4+T细胞过继组小鼠胰岛内见明显炎性浸润，胰岛结构尚完整。 结论:致病性CD4+T细胞单独过继转移引起受者小鼠胰岛炎出现而血糖维持正常，表明在诱导T1DM发病过程中，致病性CD4+T细胞主要介导对胰岛的炎性浸润，而非最终效应细胞，在T1DM发病初期起重要作用。 第三部分转录因子T-bet/GATA-3mRNA表达与1型糖尿病发病相关性研究 目的:分析1型糖尿病（T1DM）发病小鼠转录因子T-bet/GATA-3mRNA表达与Th1/Th2两类细胞因子的相关性，从转录因子角度考证1型糖尿病Th1/Th2细胞分化趋势，探讨T-bet/GATA-3在1型糖尿病发病中的作用。 方法:40mg/kg剂量链脲佐菌素（STZ）连续5d腹腔注射（ip）在BALB/c小鼠体内建立STZ诱导的T1DM小鼠模型，于末次STZ后4wk处死发病小鼠进行实验；另于SPF环境中饲养非肥胖性糖尿病（NOD）小鼠至22wk龄，后随机选择发病小鼠行相关检测。各组小鼠处死后，采用Trizol一步法提取脾脏总RNA，逆转录（RT）反应制备cDNA，聚合酶链反应（PCR）检测脾脏T-bet、GATA-3转录因子和IFN-γ、IL-4细胞因子基因表达状况，并采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测血清细胞因子IFN-γ、IL-4含量。 结果:STZ诱导T1DM模型小鼠和NOD小鼠，在糖尿病发病后脾脏T-bet、IFN-γmRNA表达均明显增加，GATA-3mRNA表达显著降低，IL-4mRNA表达在各实验组均未检出。ELISA检测显示，糖尿病发病小鼠（包括STZ诱导T1DM模型小鼠和NOD小鼠）血清中IFN-γ浓度均明显高于对照组小鼠（P<0.01），IL-4水平有所下降，但无统计学意义。 结论:T1DM发病时，小鼠脾脏转录因子T-bet/GATA-3mRNA表达与血清Th1/Th2型细胞因子含量相对应，表明转录因子T-bet/GATA-3通过影响Th1/Th2细胞分化，与1型糖尿病发病密切相关。