二硫化碳对共培养大鼠睾丸支持-生精细胞凋亡和凋亡相关蛋白表达的影响

摘要

二硫化碳（CS2）是一种应用广泛的有机溶剂。对男（雄）性影响的报道主要表现为性功能由亢进到减退，精子数减少，活动力下降和畸形精子数增多等。但有关CS2对男（雄）性生殖损伤作用机制的研究鲜有报道。本实验以共培养大鼠睾丸支持-生精细胞为研究对象，初步探讨CS2对大鼠睾丸细胞凋亡作用和凋亡相关蛋白表达的影响，为揭示其基因调控机制，阐明CS2生殖毒性的作用机制提供科学依据。 本实验通过建立大鼠睾丸支持-生精细胞共培养体系，运用Feulgen氏核染色法对支持细胞和生精细胞进行鉴定，然后以CS2作为受试物，对共培养大鼠支持-生精细胞进行染毒，用MTT比色法检测其对共培养细胞存活率的影响。用TUNEL法检测支持细胞和生精细胞的凋亡指数，并用Western blot方法对不同浓度CS2处理过的共培养细胞P53和Bcl-2蛋白进行半定量检测，用免疫细胞化学方法对不同浓度CS2处理过的共培养细胞Fas和FasL蛋白进行定位以及粗定量。 实验结果表明，本实验方法建立的大鼠睾丸支持-生精细胞共培养体系，在不添加任何细胞因子的条件下，生精细胞能够贴附于支持细胞层上生长，并在体外较长时间共生。在CS2作用下，细胞相对存活率随染毒浓度的增高而降低，当CS2浓度≥100mmol/L时，共培养的支持细胞与生精细胞相对存活率明显降低（P<0.05）。凋亡指数亦随染毒浓度的增高而增大（P<0.05和P<0.01）。P53和Bcl-2蛋白表达水平均随CS2染毒浓度增高而增高，各CS2浓度组P53蛋白表达水平均显著高于对照组（P<0.05），100mmol/L和200mmol/L浓度组Bcl-2蛋白表达水平也显著高于对照组（P<0.05）。各CS2浓度组Fas和FasL的表达量较对照组明显增高。 从以上结果可以看出：在本实验建立的体外共培养体系中，生精细胞可以贴附与支持细胞层上生长，并与之较长时间在体外共生，Feulgen氏核染色法用于鉴定支持细胞和生精细胞简单、易行，本文认为这个培养体系和鉴定方法为深入研究化学物质对支持细胞和生精细胞的生殖毒性及毒作用机制提供了细胞模型；CS2对体外共培养的支持-生精细胞具有细胞毒作用，可使细胞存活率下降，细胞凋亡率增高，最终导致精子数量减少；CS2可诱导共培养大鼠支持-生精细胞P53、Bcl-2、Fas及FasL的表达，Fas和FasL表达上调，启动Fas系统使生精细胞发生凋亡，P53的表达增高进一步促使凋亡的发生，而Bcl-2的高表达可能是为抑制凋亡的发生而产生的保护性反应。因此P53、Bcl-2和Fas系统参与了CS2诱导支持细胞和生精细胞凋亡的基因调控过程，这为进一步探讨其基因调控机制，阐明CS2致男（雄）性生殖损伤的机理，保护职业人群的健康提供了科学依据。