膜蛋白转运与囊泡转运中几种相关蛋白的表达纯化与结晶

摘要

囊泡转运和融合过程在膜蛋白转运与细胞分泌途径中发挥重要的功能。葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)是唯一一个响应胰岛素刺激转运上膜的葡萄糖转运蛋白家族成员,它在胰岛素作用下的转运上膜是血糖调控的一个重要过程。GLUT4储存囊泡(GSV)的转运和融合涉及复杂的蛋白质相互作用,其中Synip与Stx4的结合影响SNARE复合物的形成来阻断GSV的融合。为了获得蛋白质晶体结构,本研究首创了一种原核重组共表达系统,成功获得Stx4与SynipC端的蛋白质复合物,这项工作为进一步研究Stx4与Synip复合物的相互作用与晶体结构提供了良好的基础。进一步研究发现Stx4与Synip可能是以1:1的分子比例形成复合物,并且Stx4蛋白的N端1~28个氨基酸不参与相互作用。
　　在细胞中发挥着重要功能的Ⅳ型膜蛋白是一类特殊的膜蛋白,也称为尾部锚定蛋白,包括囊泡转运相关的SNARE蛋白,细胞凋亡相关的Bcl-2,以及内质网蛋白通道Sec61β等等。TRC40蛋白能够识别Ⅳ型膜蛋白新生肽链的跨膜区,并协助其转运进入内质网膜。在本研究中,通过原核重组表达和层析纯化后,以悬滴气相扩散法获得了TRC40全长蛋白质的晶体,晶体衍射分辨率达到2埃,初步晶体学分析显示一个不对称单位中、含有两个蛋白分子。晶体结构解析工作正在进行中。本研究为TRC40蛋白的结构解析乃至了解Ⅳ型膜蛋白的翻译后转运机制奠定了重要的基础。
　　钙释放激活钙(CRAC)通道介导的胞外钙离子进入胞内的方式是细胞内钙离子增加的最主要方式,在细胞中特别在免疫系统的细胞中发挥着重要作用。内质网单次跨膜蛋白STIM1蛋白被鉴定为细胞钙库中钙离子的感受器和CRAC通道的激活分子,当内质网钙库损耗时,STIM1通过位于内质网内的N端EF手性结构与SAM结构域感应钙离子丰度从而刺激CRAC通道的开放。本研究重组表达和纯化了大量高纯度的6*His标记的重组STIM1蛋白位于内质网内的 N端结构域,并对STIM1蛋白N端结构域的结晶条件进行了摸索,初步获得C端6*His标记的STIM1蛋白N端结构域的针状晶体,为进一步的晶体结构解析创造了有利条件,从而揭示STIM1蛋白是如何感应细胞内钙库的分子机制。
　　膜蛋白转运与囊泡转运在细胞活动中发挥了重要作用,与许多重大疾病有着重要关系,通过蛋白质晶体学与结构生物学的研究有助于清晰地阐述相关蛋白质与蛋白质复合物调控的分子机制,并为一些相关疾病的药物设计奠定基础。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

1 绪论与研究背景

1.1 囊泡转运与分泌

1.2 膜蛋白GLUT4转运

1.3 Ⅳ型膜蛋白(TA蛋白)转运机制

2 实验原理和研究方法

2.1 蛋白质晶体学概述

2.2 X-射线衍射与晶体结构解析

3 GLUT4转运蛋白Stx4-Synip复合物的表达与纯化

3.1 前言

3.2 实验材料和方法

3.3 实验结果与讨论

3.4 小结与讨论

4 Ⅳ型膜蛋白识别因子TRC40的晶体研究

4.1 人源TRC40蛋白的表达与纯化

4.2 TRC40蛋白晶体的筛选与优化

4.3 TRC40蛋白晶体的衍射与数据收集

4.4 反常散射法解析结构的尝试

4.5 小结与讨论

5 人源STIM1蛋白N端结构域的纯化与结晶

5.1 前言

5.2 实验材料和方法

5.3 实验结果与讨论

5.4 小结与讨论

6 全文总结与展望

致谢

参考文献

附录1 攻读博士学位期间发表或待发表的学术论文

附录2 主要符号和缩略词表