胰岛素样生长因子-1对HK-2细胞缺氧复氧损伤的相关保护作用研究

摘要

目的：探讨研究缺氧复氧损伤对人肾小管上皮细胞的损害和在胰岛素样生长因子-1(IGF-1)干预后对细胞凋亡基因相关蛋白Bcl-2和水通道蛋白AQP-1的影响及可能保护机制。
　　 方法：常规体外培养HK-2细胞，无血清培养基同步化培养24h后随机分为5组：①正常对照(C组)：细胞不予特殊处理，按常规方法培养。②缺氧复氧损伤模型组(H/R组):用终浓度300μmol/L的氯化钴(CoCl2)处理60min后更换成含10[％]FBS的DMEM/F12培养基，继续常规培养24h；③预先给药组(B组):预先给予终浓度200ng/ml的IGF-1，培养60min后去除上清液，换为终浓度300μmol/L的CoCl2培养孵育60min，再更换为10[％]FBS的DMEM/F12培养液常规培养24 h。④即时给药组(S组):同时给予HK-2细胞终浓度300μmol/L的CoC12和终浓度200ng/ml的IGF-1，培养60min后更换为10[％]FBS的DMEM/F12培养液继续培养24 h。⑤延迟给药组(A组):先用终浓度300μmol/LCoCl2模拟缺氧，处理60 min后去上清液，加入终浓度200ng/ml的IGF-1培养1h，更换为正常10[％]FBS的DMEM/F12培养液后继续常规培养24 h。上述各实验组细胞处理完后：倒置相差显微镜下观察细胞形态，用MTT法检测细胞增殖活性、流式细胞仪分析细胞凋亡情况、LDH试剂盒检测各组细胞上清液LDH漏出量，细胞免疫组化方法检测Bcl-2与AQP-1的表达变化、Real-time 荧光定量PCR检测Bcl-2 mRNA与AQP-1 mRNA表达水平变化。
　　 结果：⑴成功构建HK-2细胞缺氧复氧模型；⑵ MTT法测细胞OD值：H/R组较C组明显降低(P<0.05)，3个IGF-1 干预组较H/R组OD值有所升高，以B组上升最明显(P<0.01)。⑶流式细胞仪测得细胞凋亡率：正常C组仅存在极低凋亡率(2.06±0.38[％])，H/R组细胞凋亡率较C组明显升高(P<0.05)，3个IGF-1 干预组较H/R组显著下降(P<0.05)，其中又以B组下降最明显(P<0.01)。⑷细胞上清液的LDH 漏出量;缺氧复氧损伤模型组(H/R组)LDH 活性较C组显著增加(P<0.01)，IGF-1 干预处理组较H/R组漏出量减少，以B组降低最明显(P<0.01)。⑸免疫组化和实时荧光定量PCR显示：H/R组AQP-1mRNA和Bcl-2 mRNA表达较C组降低(P<0.05)，细胞免疫组化显示AQP-1 与Bcl-2蛋白表达下降(P<0.05)。给予IGF-1干预后，Bcl-2mRNA、AQP-1mRNA和其蛋白表达量均增加(P<0.05)，尤以B组增加最明显(P<0.01)。
　　 结论：IGF-1能够抑制缺氧复氧损伤所造成的HK-2细胞凋亡，可能与其上调Bcl-2蛋白有关；IGF-1可改善HK-2细胞的缺氧复氧损伤程度，能够增强AQP-1mRNA和蛋白的表达；IGF-1 预先干预对缺氧复氧损伤有着更好的保护作用。