葡萄籽提取物原花青素对人膀胱癌细胞生长的抑制作用及机制研究

摘要

本研究分为四部分：
　　 第一部分：葡萄籽提取物原花青素对人膀胱癌BIU87细胞的生长抑制作用
　　 目的：探讨葡萄籽提取物原花青素(grape seed procyanidin extract，GSPE)对人膀胱癌BIU87细胞及人原代皮肤成纤维细胞生长的影响。
　　 方法：体外培养的人膀胱癌BIU87细胞及人原代皮肤成纤维细胞与12.5、25、50、100和200 μg/ml GSPE共同孵育24 h后，观察细胞形态学改变；并采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定其对人膀胱癌BIU87细胞及人原代皮肤成纤维细胞存活的影响。
　　 结果：与对照组相比，50、100、200 μg/ml GSPE可引起BIU87细胞形态的明显改变，各浓度GSPE对人原代皮肤成纤维细胞形态无明显影响。12.5、25、50、100、200 μg/ml GSPE作用细胞24 h后，人膀胱癌BIU87细胞存活率分别为对照组的99.55±0.50% (n=18，P>0.05)，99.16±0.63% (n=18，P>0.05)，86.98±1.48%(n=18，P<0.01)，68.18±2.06% (n=18，P<0.01)和51.42±1.78% (n=18，P<0.01)；与对照组相比，50、100、200 μg/ml GSPE可明显抑制BIU87细胞生长，但对人原代皮肤成纤维细胞生长无明显抑制作用。
　　 结论：在一定浓度范围内，GSPE可呈剂量依赖性抑制人膀胱癌BIU87细胞生长，但对人原代皮肤成纤维细胞的生长无明显影响。
　　 第二部分：葡萄籽提取物原花青素对人膀胱癌BIU87细胞周期的影响及其机制探讨
　　 目的：探讨GSPE对人膀胱癌BIU87细胞周期的影响及其可能机制。
　　 方法：将50、100、200 μg/ml的GSPE作用于人膀胱癌BIU87细胞24 h后，采用流式细胞术检测细胞周期改变，采用RT-PCR及Western blot方法检测cyclin D1和CDK4 mRNA及蛋白水平的表达变化。
　　 结果：流式细胞分析表明，GSPE可使人膀胱癌BIU87细胞阻滞于G1期，0、50、100、200 μg/ml GSPE对应的阻滞于G1期的肿瘤细胞平均比例分别为48.46、55.73、69.81和 79.18%。RT-PCR及Western blot分析表明，随着GSPE浓度的增高，BIU87细胞cyclin D1和CDK4 mRNA及蛋白表达减少，半定量分析显示，各浓度组间差别有明显的统计学意义 (P<0.01)。
　　 结论：GSPE可呈浓度依赖性阻滞BIU87细胞于G1期。其机制可能与下调细胞周期相关因子cyclin D1和CDK4的表达有关。
　　 第三部分：葡萄籽提取物原花青素对人膀胱癌BIU87细胞凋亡的影响及其机制探讨
　　 目的：探讨GSPE对人膀胱癌BIU87细胞凋亡的影响及其可能机制。
　　 方法：将50、100和200 μg/ml的GSPE作用于人膀胱癌BIU87细胞24 h后，采用Hoechst 33258凋亡荧光染色观察细胞核形态改变，流式细胞术检测细胞凋亡率，RT-PCR及Western blot方法检测caspase-3和survivin mRNA及蛋白的表达变化。
　　 结果：Hoechst 33258凋亡染色结果表明，GSPE可使BIU87细胞核呈现明显的凋亡形态学改变。流式细胞分析表明，GSPE可诱导BIU87细胞凋亡，0、50、100和200 μg/ml GSPE对应的BIU87细胞的平均凋亡率分别为0.3、8.7、28.2和40.6%。RT-PCR及Western blot分析表明，随着GSPE浓度的增高，BIU87细胞caspase-3 mRNA及蛋白表达增多，survivin mRNA及蛋白表达减少，半定量分析显示各组间差别均有明显的统计学意义(P<0.01)。
　　 结论：GSPE可呈浓度依赖性诱导BIU87细胞凋亡。其机制可能与下调凋亡抑制基因survivin有关。
　　 第四部分：丝裂霉素C联合葡萄籽提取物原花青素对人膀胱癌BIU87细胞的生长抑制作用
　　 目的：探讨丝裂霉素C(mitomycin C，MMC)与GSPE联合应用对人膀胱癌BIU87细胞的生长抑制作用。
　　 方法：采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定MMC与GSPE单独和联合应用时对人膀胱癌BIU87细胞生长的抑制作用，并应用Chou-Talalay联合指数(combination index，CI)法定量分析药物之间的相互作用效果。
　　 结果：MMC和GSPE单独应用时，BIU87细胞生长的抑制作用随药物浓度的增加而增加，中效浓度分别为15.422 μg/ml和195.865 μg/ml。MMC与GSPE联合应用时，作用效果表现为在低浓度(01)，中效浓度为109.496 μg/ml (其中MMC为8.111 μg/ml，GSPE为101.385 μg/ml)。
　　 结论：MMC与GSPE相互作用的效果在低浓度时呈协同作用，高浓度时呈拮抗作用。