氟虫腈对PC12细胞毒作用及其机制的初步探讨

摘要

近年来，我国农药使用量有增无减。随着2007年甲胺磷等高毒的农药被全面禁用，中等毒性的新型农药使用量均大幅上升，如氟虫腈在我国中部地区的使用量已经明显增多。氟虫腈，商品名为锐劲特，属于苯基吡唑类杀虫剂，与吡啶类杀虫剂相比，氟化苯基吡唑类农药杀虫机制独特，具有杀虫谱广的优点，并且对有机磷、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类农药有抗药性的害虫毒性效果更为明显。氟虫腈作为一种中等毒性杀虫剂，生物活性很高，是一种高效农药，对害虫具有胃毒、触杀和内吸作用，并且有效剂量与拟除虫菊酯类农药相当，其作用机制在于干扰昆虫γ－氨基丁酸控制的氯化物代谢，致使昆虫神经痉挛、麻痹致死。国际上喻其为新一代高科技杀虫剂，是第3 代新烟碱农药。但氟虫腈作为一种新型农药，也具有其致命的缺点，即氟虫腈具有较高的生态毒性，特别是对蜜蜂和水生生物（如虾、蟹）的毒性高，因此不宜在蜜蜂和虾蟹养殖地区使用。
　　 活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一种重要的氧自由基，主要包括过氧化氢和超氧化物阴离子。在生理条件下，机体内的自由基处于平衡状态，浓度很低，不仅不会对机体造成损伤，而且还具有重要的生理功能。但是，当环境中的物理因素或外源化学物质直接或间接诱导机体产生了大量自由基，并且超过了机体的清除能力，或内源性自由基产生和清除失去平衡，就会使机体处于氧化应激（oxidative stress）状态，进而使机体受到损害。活性氧与Ca2+浓度、调控蛋白Bcl-2含量等相关，并和它们一起影响着细胞凋亡。
　　 凋亡蛋白Bcl-2是原癌基因Bcl-2表达的一种蛋白质，对细胞凋亡的发生具有抑制作用。Bcl-2 蛋白抑制细胞凋亡的机制目前仍然不是很清楚，但大多认为与Bcl-2 蛋白具有的细胞内抗氧化作用以及对钙离子跨膜运动功能的抑制作用有关。
　　 本研究以大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞（PC12细胞）为模型，研究ROS和Bcl-2 蛋白在氟虫腈对细胞毒作用中的含量变化，为了解氟虫腈对体外培养细胞的毒作用机制提供实验依据。
　　 方法：
　　 实验分组为对照和7.81×10-7、3.13×10-6、1.25×10-5、5.00×10-5mol/L 四个剂量组，研究方法与内容如下：
　　 1. MTT法测定以上四个剂量组作用12h、24h和48h后对PC12细胞存活率的影响；
　　 2.形态学方法检测3.13×10-6、1.25×10-5、5.00×10-5mol/L 三个剂量组对PC12细胞凋亡与坏死的影响；
　　 3. 流式细胞术法测定3.13×10-6、1.25×10-5、5.00×10-5mol/L 三个剂量组对PC12细胞凋亡率的影响；
　　 4.免疫荧光细胞化学法测定3.13×10-6、1.25×10-5、5.00×10-5mol/L 三个剂量组作用PC12细胞24h后对Bcl-2 蛋白含量的影响；
　　 5. 比色法测定3.13×10-6、1.25×10-5、5.00×10-5mol/L 三个剂量组作用PC12细胞4h、8h、16h、24h对ROS含量的影响。
　　 结果：
　　 1.对细胞存活率影响的研究结果表明，四个剂量组在作用PC12细胞12h 均无明显毒性作用，作用24h和48h后各组细胞存活率即明显低于对照组，差异有统计学意义。
　　 2. Hoechst-PI 双参数法对细胞凋亡进行检测，荧光显微镜下观察到3.13×10-6mol/L 剂量组凋亡细胞数明显多于对照组，而5.00×10-5mol/L 剂量组死亡细胞数明显高于对照组。
　　 3. 流式细胞仪对不同剂量组细胞凋亡率及死亡率进行检测。5.00×10-5mol/L 剂量组细胞死亡率明显高于对照组，差异有统计学意义；3.13×10-6mol/L 剂量组细胞凋亡率明显多于对照组，差异有统计学意义。
　　 4.免疫荧光细胞化学法测定PC12细胞Bcl-2 蛋白表达，通过荧光显微镜对不同染毒剂量组进行荧光强度检测，3.13×10-6mol/L 剂量组荧光强度明显低于对照组。
　　 5.对不同剂量组染毒4h、8h、16h和24h后，分别对各组细胞内ROS含量进行检测。3.13×10-6mol/L 剂量组在染毒4h后ROS含量明显升高，较对照组差异有统计学意义；而5.00×10-5mol/L 剂量组在染毒24h后ROS含量明显下降，较对照组差异有统计学意义。
　　 结论：
　　 氟虫腈是一种中等毒性的农药，具有神经毒性作用，它能够使体外培养的PC12细胞存活率下降。在低剂量通过影响Bcl-2 蛋白表达，使细胞内ROS含量升高，进而促进细胞凋亡的发生；在较高剂量时可使细胞不经过凋亡途径，而直接使大量细胞发生死亡，死亡的具体机制还有待进一步研究。