缺氧微环境中HIF-1α诱导MT2-MMP表达及对胰腺癌侵袭和转移作用的机制研究

摘要

第一部分MT2-MMP与HIF-1α在胰腺癌中表达及相关性的探讨
　　 目的：探讨膜型金属蛋白酶-2（MT2-MMP）与缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在胰腺癌组织和细胞中表达及相关性。
　　 方法：应用免疫组化法检测78例胰腺癌组织中MT2-MMP和HIF-1α蛋白的表达情况，并分析两者表达的相关性；同时在体外细胞实验中，采用实时定量PCR与Western blot法检测不同缺氧时间对胰腺癌PANC-1细胞MT2-MMP与HIF-1α表达的影响；然后，探讨上调或下调HIF-1α基因表达对胰腺癌PANC-1细胞MT2-MMP蛋白表达的影响。
　　 结果：免疫组化结果显示78例胰腺癌组织中MT2-MMP与HIF-1α蛋白阳性表达率分别为57.7％和66.7％。对同一组织标本连续性切片观察发现MT2-MMP与HIF-1α蛋白表达的区域分布有呈明显重叠，进而采用Spearman双变量相关性分析显示胰腺癌组织中MT2-MMP与HIF-1α蛋白表达水平呈高度正相关（r=0.619，P<0.001）。体外细胞实验显示胰腺癌PANC-1细胞MT2-MMP Mrna和蛋白的表达水平随着缺氧（1％O2）时间延长而不断增加，且具有显著的时间依赖性（P<0.05）。其后，我们采用缺氧诱导剂CoCl2或HIF-1α表达质粒上调PANC-1细胞HIF-1α基因的表达，结果发现MT2-MMP蛋白的表达水平随着HIF-1α表达量的增加而上升（P<0.05）；而利用HIF-1α特异性抑制剂YC-1或HIF-1αsiRNA阻断HIF-1α的表达，MT2-MMP蛋白的表达水平则随着HIF-1α表达量的减少而下降。
　　 结论：MT2-MMP和HIF-1α在胰腺癌组织和细胞中均有不同程度的表达，并且二者表达呈高度正相关。
　　
　　 第二部分
　　 目的：恶性肿瘤的进展需要肿瘤细胞不断适应低氧微环境，该过程主要是由转录因子HIF-1α通过调控缺氧反应基因的表达来实现的。本部分研究将进一步阐明缺氧微环境下转录因子HIF-1α对胰腺癌细胞中MT2-MMP基因表达调控作用的分子机制。
　　 方法：我们首先构建MT2-MMP基因启动子全长的报告基因载体，明确HIF-1α是否直接结合于MT2-MMP基因启动子上激活其转录；然后通过构建截短和突变的MT2-MMP基因启动子的报告基因载体，寻找并定位MT2-MMP基因启动子上HIF-1α结合位点；随后分别采用HIF-1α结合/竞争实验和染色质免疫沉淀（ChIP）实验，进一步确认HIF-1α能否在体外和体内直接结合到MT2-MMP基因启动子的HIF-1α结合位点上。
　　 结果：我们将成功构建MT2-MMP基因启动子全长的报告基因载体和Prl-TK质粒共转染PANC-1细胞，结果发现缺氧条件下HIF-1α直接结合于MT2-MMP基因启动子上并启动其转录；然后通过构建截短和突变的MT2-MMP基因启动子的报告基因载体，证实在定位在MT2-MMP启动子上的nt-264 HRE1序列是缺氧诱导MT2-MMP转录激活所必不可少的条件。进一步通过HIF-1α结合/竞争实验和ChIP实验证实HIF-1α在体内体外都能特异性地结合到MT2-MMP基因启动子上的一个功能性HRE1位点上。
　　 结论：缺氧微环境下HIF-1α通过直接与MT2-MMP基因启动子的功能性HRE1位点结合，激活MT2-MMP基因的转录，这发现揭示了一个调控肿瘤细胞MT2-MMP基因表达的新机制。
　　
　　 第三部分调控MT2-MMP基因表达对胰腺癌细胞增殖、凋亡和侵袭
　　 目的：通过利用特异性MT2-MMP干扰质粒或过表达质粒调控MT2-MMP基因表达，探讨其表达对胰腺癌PANC-l细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。
　　 方法：构建靶向沉默MT2-MMP siRNA干扰质粒和MT2-MMP过表达真核表达质粒，通过脂质体转染法稳转至人胰腺癌PANC-1细胞株。通过采用实时定量PCR和Western blot法验证PANC-1细胞中MT2-MMP基因的表达情况。我们利用CCK-8比色法检测调控MT2-MMP的表达对胰腺癌细胞增殖能力的影响；流式细胞术检测胰腺癌细胞的凋亡率变化；Transwell细胞侵袭实验观察对PANC-1细胞侵袭能力的影响。
　　 结果：成功构建pGenesil-MT2-MMP-siRNA干扰质粒和Pdna3.1-His-MT2-MMP表达质粒。经实时定量PCR和Western blot实验证实MT2-MMP过表达组PANC-1细胞MT2-MMP Mrna和蛋白表达水平明显上调，而siRNA稳转组MT2-MMP表达显著下调。研究发现MT2-MMP过表达组PANC-1细胞的增殖能力明显高于比MT2-MMP siRNA组（P<0.05）；MT2-MMP过表达组的细胞凋亡率较MT2-MMP siRNA组明显减少（P<0.05）；并且MT2-MMP过表达组穿膜细胞数明显多于MT2-MMP siRNA组，其数值分别216.4±18.6个/视野和75.8±8.2个/视野（P<0.05）。
　　 结论：研究发现特异siRNA沉默MT2-MMP基因表达后能抑制缺氧条件下胰腺癌PANC-1细胞增殖和侵袭，并促进细胞凋亡；而上调MT2-MMP基因表达可促进细胞增殖和侵袭，抑制细胞凋亡，这一发现提示MT2-MMP可能是一个促癌基因，为将来基因靶向治疗胰腺癌提供了新的思路。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分MT2-MMP与HIF-1α在胰腺癌中表达及相关性的探讨

第二部分缺氧微环境中HIF-1α对MT2-MMP基因表达调控作用的分子机制

第三部分调控MT2-MMP基因表达对胰腺癌细胞增殖、凋亡和侵袭

综述一缺氧诱导因子-1α与胰腺癌生长、侵袭和转移的关系

综述二膜型基质金属蛋白酶与肿瘤的侵袭和转移的研究进展

附录一英文缩略词表

致谢