依赖p53的癌基因Wip1在人脑胶质瘤细胞恶性增殖机制中的作用研究

摘要

第一部分 Wip1基因在人脑胶质瘤中的表达及其与p53/p14ARF信号通路失活的关系
　　 目的：胶质瘤通常伴有p53的突变。Wip1基因抑制并负反馈调节p53功能而表现出癌基因的特性。本研究拟探讨Wip1基因在脑胶质瘤组织中的表达及其与p53/p14ARF信号通路失活的关系。
　　 方法：实时定量PCR及Western Blot法检测8例正常脑组织及52例不同病理分级的脑胶质瘤组织中Wip1基因的表达，直接测序法检测p53基因的突变情况，逆转录PCR及甲基化PCR检测p14ARF的表达情况，统计学分析其相关性。
　　 结果：52例胶质瘤样本中p53/p14ARF信号通路失活30例（57.7％）。22例无p53或p14ARF改变的样本中，11例伴有Wip1mRNA过表达；而p53/p14ARF信号通路失活30例中，仅1例（3.3％）伴有Wip1mRNA过表达。Wip1在脑胶质瘤中存在着选择性的过表达，过表达的Wip1主要与p53野生型相关而与p14ARF的甲基化状态及转录子表达无关。
　　 结论：Wip1在脑胶质瘤中存在选择性的过表达；Wip1基因在脑胶质瘤中的过表达与p53/p14ARF信号通路的失活有关，Wip1基因可能抑制p53/p14ARF信号通路。
　　 第二部分 Wip1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及有效靶点的筛选
　　 目的：构建人Wip1基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒载体，测定病毒滴度，并对不同靶点进行筛选，挑选干扰效率最高的靶点。
　　 方法：根据人Wip1基因序列，设计三对Wip1基因特异性RNAi靶序列，经退火制备双链DNA oligo，连接到 pFU-GW-iRNA载体，转化后经PCR鉴定，阳性克隆测序证实，慢病毒包装转染293T细胞，获得病毒上清并测定其滴度。将病毒上清感染人胶质瘤细胞株U251和U-87MG，实时定量PCR及Western blot鉴定RNA干扰效率，筛选出基因沉默效率最高的慢病毒载体。
　　 结果：PCR扩增和测序结果表明成功构建Wip1基因慢病毒干扰载体，慢病毒载体包装获得的病毒上清滴度在3～8×108 TU/ml。可以有效地沉默U251细胞及U-87MG细胞中Wip1基因的表达，构建的RNA干扰慢病毒载体感染U251细胞后Wip1基因的mRNA表达量同对照组相比较分别为36.3％、32.9％、23.8％；在U-87MG中则分别为48.8％、36.7％和 23.7％。Western blot结果显示Wip1蛋白表达量在感染细胞7 d后显著下降。
　　 结论：成功构建人Wip1基因的RNA干扰慢病毒载体并筛选出最佳靶点，为进一步研究Wip1基因在胶质瘤细胞中的作用提供可靠的实验平台。
　　 第三部分 Wip1基因在人脑胶质瘤细胞恶性增殖中的作用及其机制的研究
　　 目的：研究Wip1基因在人脑胶质瘤细胞恶性增殖中的作用及探讨其可能的作用机制。
　　 方法：Wip1基因RNA干扰慢病毒载体感染胶质瘤细胞U251及U-87MG。CCK-8法(cell counting kit-8)及克隆形成实验检测细胞的增殖能力；流式细胞术Annexin V-APC/PI双标法及Hoechst 33258染色检测细胞的凋亡情况；流式细胞术PI单染法检测细胞周期分布；Transwell实验检测细胞的侵袭性；实时定量PCR法检测Wip1基因沉默后差异性基因的mRNA表达；Western blot检测Wip1可能作用途径的基因的蛋白表达。SPSS 13.0软件分析统计学差异。
　　 结果：胶质瘤中Wip1基因的表达被有效沉默。Wip1基因沉默的胶质瘤细胞增殖变慢，在U-87MG细胞中更加明显；转染慢病毒载体的U-87MG和U251细胞在4 d时凋亡无明显变化，但7 d和10d时出现明显的凋亡，且凋亡率随着时间的延长而逐渐增加，U-87MG细胞的凋亡率为52.2％和67.1％，U251则分别为26.1％和38.2％。U-87MG在慢病毒感染后10d与U251细胞相比，凋亡率明显要高（P＜0.05）；Hoechst 33258染色显示Wip1基因沉默后的胶质瘤细胞中可以观察到典型的细胞凋亡的形态学改变如核浓缩、核碎裂；细胞周期分析显示Wip1基因沉默对U251细胞周期无明显影响，而U-87MG细胞则在10d时出现明显的S期增多和G1、G2期细胞的减少；U-87MG细胞在Wip1基因沉默后出现明显的体外侵袭力下降。Wip1基因沉默后，U251细胞PIK3R1基因出现上调，伴有CDKN2A和p14ARF基因的下调，而在U-87MG细胞中他们的表达均上调；Western blot结果显示两种胶质瘤细胞中的p38MAPK的表达均上调，而Akt的表达均下调，但是p-Akt（Ser473）却只在U-87MG细胞中存在上调。在U-87MG细胞中p53及p-p53（Ser 15）表达均上调，但在U251细胞中无明显变化。
　　 结论：Wip1对胶质瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭具有重要的作用，并且这种作用主要与其调节p53的功能有关。

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文摘

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声明

前言

第一部分Wip1基因在人脑胶质瘤中的表达及其与p53/p14ARF信号通路失活的关系

第二部分Wip1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及有效靶点的筛选

第三部分Wip1基因在人脑胶质瘤细胞恶性增殖中的作用及其机制的研究

综述：原癌基因Wip1的研究进展

附录

致谢