一、EST3对tmTNF-α杀伤功能的影响及机制的初探；二、tmTNF-α保守序列与其三聚体化相关性研究

摘要

本文主要从下几个部分展开：
　　 第一部分EST3 对tmTNF-α杀伤功能的影响及机制的初探
　　 肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factor-alpha，TNF-α）作为一种多功能的细胞因子，具有广泛的生物学效应，可参与细胞增殖、分化，杀伤肿瘤细胞，发挥免疫调节作用等；还可作为炎症介质参与发热、慢性感染。TNF-α以两种生物活性形式存在，即17kDa的分泌型TNF-α(secreted TNF-α，sTNF-α)和26kDa的跨膜型TNF-α(transmembrane TNF-α，tmTNF-α)。tmTNF-α是 sTNF-α的前体，主要表达在活化的单核细胞和免疫细胞表面。细胞膜表面的tmTNF-α在TNF转化酶（TACE/ADAM17）的作用下，被剪切释放出sTNF-α。
　　 本课题组前期工作证实两型TNF-α的杀瘤效应存在明显差异，即两型TNF 均与TNFR 结合发挥效应，但诱导同一靶细胞死亡的方式却明显不同，tmTNF-α主要诱导细胞凋亡，sTNF-α主要诱导细胞坏死。进一步利用抑制性消减杂交技术，获得两型TNF-α激活的差异表达基因片段即tmTNF-α特有的功能相关基因EST3(GenBank 登录号AW675924）。经与Blast 比对，确认EST3 属S2 核糖体蛋白家族分子。但是，该分子对tmTNF-α生物学功能的影响和机制尚不清楚。本研究构建正反向EST3及其突变体，初步探讨EST3及其重要功能域对tmTNF-α杀瘤功能的影响及其分子机制。
　　 第二部分tmTNF-α保守序列与其三聚体化相关性研究
　　 肿瘤坏死因子超家族(tumor necrosis factor superfamily，TNF-SF)，包括TNF-α、TNF-β、LT-β、CD27L、CD30L、CD40L、CD95L(FasL）、41BB、OX40L、TRILL等20个成员，它们的共同特征是形成三聚体结构，虽然各个成员的氨基酸序列、空间构型、结合受体及其生物学作用均不相同，但这些膜蛋白的共同特征是具有三聚体化倾向，并且三聚体是这些分子的生物活性形式。它们在一级结构上的唯一共同之处就是其胞外段的高度保守氨基酸序列。故我们推测TNF 超家族成员的高度保守序列很可能是形成其共同特征即三聚体化的分子基础。
　　 肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）为TNF-SF的成员之一，参与炎症反应、免疫应答、抗肿瘤和内毒素性休克等。分子生物信息学研究进一步提示tmTNF-α单体间相互连接部位正好位于高度保守序列，即tmTNF-α一级结构中的9-16、48-62、119-132、151-157位氨基酸片段。为了阐明TNF 超家族保守序列与TNF 超家族成员三聚体结构的关系，本课题通过突变这些保守序列中可能参与三聚体形成的关键氨基酸位点，观察对三聚体形成及其生物学活性的影响，以确认参与三聚体形成的关键氨基酸。本研究主要结果如下：
　　 一．tmTNF-α及tmTNF-α突变体重组质粒构建与鉴定：利用重叠PCR 技术，构建保守片段缺失的tmTNF-α突变体（Δ 54-59、Δ 119-126、Δ 119-124、Δ 119-122、Δ 119-120、Δ 115-118）及点突变体（H15P、G54F、G54N、I58A、I58Y、G121F、F124A、F124S、L126T、F152S和G153F），经菌落PCR 鉴定、酶切鉴定及测序鉴定确认除预期突变外，无任何其它点突变，移码和缺失突变，提示突变体构建成功。
　　 二．tmTNF-α及其突变体转染效率与表达率的分析：将tmTNF-α及其突变体转染293T细胞后，用GFP 检测tmTNF-α及其突变体转染效率，用TNF 抗体检测tmTNF-α及其突变体的表达率。实验结果表明，各突变体除I58Y、F124A、F124S和G153F 外，转染效率和表达率与野生型tmTNF-α无显著差异，提示这些突变体基本不影响蛋白合成与在膜上的表达。
　　 三．tmTNF-α保守氨基酸突变对tmTNF-α杀伤功能的影响：采用胞毒实验证实，缺失保守片段Δ 54-59 与Δ 119-126的tmTNF-α胞毒作用几乎全部消失，后一片段从缺失8个减少至缺失2个氨基酸，均无胞毒效应；保守位点的点突变中H15P、G54F、G54N、I58Y和L126T 点突变使tmTNF-α胞毒效应几乎完全丧失，而其它位点突变对tmTNF-α杀伤效应均有不同程度的影响（抑制率40％-80％）。提示tmTNF-α保守序列或位点突变均可影响tmTNF-α的生物学功能。
　　 四．tmTNF-α保守氨基酸突变对其三聚体形成的影响：用化学交联检测tmTNF-α及其突变体是否影响三聚体的形成，结果显示转染野生型tmTNF-α、G54N-tmTNF-α和I58A-tmTNF-α可见清晰的二聚体和三聚体的形成，而H15P、G54F和I58Y 点突变以及所有的缺失突变的突变体只在单体位置可见特异性条带，故推测tmTNF-α能否形成三聚体不但与保守序列突变的位点相关，而且与突变的氨基酸性质相关。提示上述突变体影响tmTNF-α的杀伤功能可能与其不能形成三聚体有关。
　　 五．tmTNF-α保守位点突变对 sTNF-α释放及其生物学功能的影响：
　　 1.转染tmTNF-α突变体的细胞培养上清的杀伤功能减弱：收集tmTNF-α及其突变体48小时的细胞培养上清，用MTT法观察上清中sTNF-α的胞毒作用。结果显示，转染野生型tmTNF-α细胞培养上清有明显的杀伤作用，而转染缺失突变体的细胞培养上清几乎丧失杀伤效应；H15P、G54F、I58Y和F124S 点突变使sTNF-α胞毒作用几乎丧失；其余点突变体部分损害其胞毒效应。上述结果提示，tmTNF-α保守性氨基酸突变明显影响其上清的胞毒作用，其原因可能是产生的sTNF-α因丧失三聚体而失活，或膜分子在单体的情况下不能被酶解成分泌型分子。
　　 2.tmTNF-α保守氨基酸突变对 sTNF-α释放的影响：为证实上述推测，我们用ELISA检测转染tmTNF-α及其突变体细胞培养上清中sTNF-α的水平。结果显示转染野生型tmTNF-α细胞的培养上清中有大量sTNF-α(达593.29pg/ml），而转染缺失突变的tmTNF-α细胞培养上清均未检测到sTNF-α；转染点突变的tmTNF-α细胞中，H15P、I58Y和F124S 未检测到sTNF-α，而G54F、G54N和I58A 可检测到sTNF-α的分泌，且与野生型tmTNF-α组无统计学差异。提示tmTNF-α可因保守序列缺失或某些位点突变而不被水解成sTNF-α，这可能与突变体不能形成三聚体有关。
　　 六．FasL 对应TNF的保守位点突变对其生物学效应的影响
　　 1.FasL及其突变体重组质粒的构建与鉴定：上述结果证实His 15和Gly 54是 tmTNF-α三聚体形成的关键性保守位点，故我们在FasL 相应的位点上构建相同的突变体（H49P和G88F），经菌落PCR 鉴定、酶切鉴定及测序鉴定确认除预期突变外，无任何其它点突变，移码和缺失突变，提示突变体构建成功。
　　 2.Annexin V-PI法检测FasL及其突变体的胞毒作用：采用5mM PHA 刺激Jurkat T细胞12小时，使Fas表达率大约为30％左右，AICD 率为35％，并以此状态的Jurkat T 细胞作为靶细胞，以FasL及其各突变体转染293T 细胞为效应细胞，观察其诱导的凋亡率。结果显示：只有转染野生型FasL的细胞才有杀伤作用，其突变体均丧失胞毒效应，提示TNF 超家族的保守序列对维持该家族成员的生物学效应具有重要作用。
　　 结论：（1）tmTNF-α的保守序列54-59 与119-126片段对该分子三聚体的形成及生物学活性具有重要作用，后一片段缩短至2个氨基酸缺失仍能发挥作用。（2）tmTNF-α的保守序列中His 15、Gly 54和Ile 58 为三聚体形成的关键氨基酸位点。（3）干扰TNF-α膜分子三聚体的形成，不但使其杀伤活性丧失，且可能抑制其可溶性分子的产生。（4）tmTNF-α保守氨基酸同样影响TNF 家族其他成员如FasL的胞毒作用，是否与其三聚体形成相关，尚待研究。
　　 本研究初步阐明tmTNF-α保守序列为其三聚体化和生物学功能所必须，并影响TNF 超家族其他成员FasL的杀伤效应；该研究为tmTNF-α及TNF 超家族的结构与功能的关系提供了重要的实验依据。

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文摘

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第一部分 EST3 对tmTNF-α 杀伤功能的影响及机制的初探

第二部分 tmTNF--α 保守序列与其三聚体化相关性的研究

本论文主要创新点

参考文献

综 述:跨膜型肿瘤坏死因子-α：结构，功能及其与抗肿瘤制剂的相互作用

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