检测细菌内毒素的酶联免疫吸附法及免疫传感器法的研究

摘要

细菌内毒素广泛存在于空气、土壤和水等环境介质当中，与人体健康密切相关，一定剂量的内毒素在人体免疫功能低下或有创面情况入侵后，机体本身不会刺激足够的体液免疫来使毒素失效，极微量（1-5ng/公斤体重）的内毒素就能导致机体体温升高，而后引起的有害症状通常包括：致热反应、白细胞数目减少、Shwartzman 反应、全身炎症反应综合症（SIRS）、内毒素血症和低血压、多脏器功能衰竭综合症（MODS）等。
　　 目前，用于细菌内毒素的检测方法有：家兔热原试验法、鲎实验法、酶联免疫测定法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和生物传感器等。家兔热原试验法由于不能定量、耗时和敏感度不高等缺点有被逐渐淘汰的趋势。鲎试验法是目前内毒素检测的金标准，已被广泛的应用于临床和环境中的内毒素检测，具有快速、简便、灵敏度高（0.01EU/mL）、易推广标准化等优点。但是一些本身带有颜色及浊度较高的样品会影响检测结果，同时鲎试剂的制备需要捕杀大量稀有动物鲎，因此，寻找鲎试剂的替代方法成为研究的重点。ELISA 由于兼有抗体的高特异性和酶的放大作用而被应用于内毒素的检测，能免于样品颜色的干扰。缺点在于检测精度较鲎试验法低，故在实际检测中应用较少。传感器的特点在于其物理元件测量速度快、灵敏度高等，能将微小环境的变化转化为可测的光电信号，与具有生物活性物质联合检测内毒素是目前传感器研究的方向。
　　 本文通过制备出抗内毒素的兔多克隆抗体血清，将多粘菌素B（Polymyxin B，PMB）与抗体联合建立夹心ELISA（Sandwich ELISA，sELISA）法检测内毒素，并进一步研制出基于PMB 吸附作用的免疫传感器。
　　 第一部分大肠杆菌内毒素多克隆抗体的制备及其在间接竞争性ELISA中的应用
　　 目的：制备大肠杆菌内毒素的兔多克隆抗体；探讨ELISA法检测大肠杆菌精制内毒素的灵敏度；并研究其与细菌复合型内毒素的反应。
　　 方法：将大肠杆菌精制内毒素作为免疫抗原免疫家兔，并每周于兔耳缘取少量血制备血清测其效价，第五次免疫一周后心脏取血；将一定量的精制内毒素包被于96孔板中，再同时加入定量的抗内毒素的兔多克隆抗体和不同浓度的内毒素，建立用于检测内毒素的间接竞争性ELISA(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay，icELISA)，并优化包被用大肠杆菌精制内毒素抗原和检测用兔多抗的最佳使用浓度；同时比较兔多抗与羊多抗对精致型内毒素和复合型内毒素的反应效果。
　　 结果：随着逐次提高免疫剂量免疫家兔后，抗内毒素血清的效价逐渐提高，在第五次免疫后OPD底物显色效价达到1:6400（TMB底物显色为1:16000）；在包被抗原浓度为100μg/mL和兔多抗使用稀释比为1:500的最佳使用条件下建立检测精制内毒素的icELISA，结果显示：内毒素检测范围在0.1μg/mL～100μg/mL内，与O.D值的成反比例关系，线性范围回归方程为：y=-0.1 ln(x)+0.765，相关系数R2为0.982，最低检测限为100ng/mL；兔多克隆抗体与羊多克隆抗体均能与大肠杆菌O157:H7菌液内的复合型内毒素发生反应，反应效价分别为1:16000与1:32000。
　　 结论：成功制备出内毒素兔抗多克隆抗体，其效价与国内同类抗体效价相当，与国外商品化的羊多克隆抗体相比较，能与精致型、复合型内毒素（游离型类毒素和细胞结合型内毒素）反应，实用性更为广。
　　 第二部分多粘菌素B与抗体联用的sELISA 法检测内毒素
　　 目的：建立多粘菌素B（Polymyxin B，PMB）与抗内毒素兔多克隆抗体联合的PMB-ET-pAB sELISA 用于内毒素的检测。
　　 方法：将一定浓度的多粘菌素B 包被于96孔板中，封闭后逐次加入不同浓度的内毒素、固定稀释度的内毒素抗血清和酶标抗体，显色后于酶标仪A492nm 处检测O.D 值；并与使用多克隆抗体建立检测内毒素的icELISA 相比较。
　　 结果：PMB-ET-pAB sELISA 法最适条件为PMB10μg/mL、抗内毒素抗体稀释度1:500、HRP 标记驴抗兔lgG 稀释度1：2000。测精制内毒素的结果显示：在0.1μg/mL～100μg/mL 范围内，内毒素浓度与O.D 值的成正比例关系，线性范围回归方程为：y=-0.094 ln(x)+0.227，相关系数R2 为0.914，最低检测限为100ng/mL，
　　 结论：PMB与抗体联合建立的PMB-ET-pAB sELISA 成功，且检测限与单纯使用多抗的sELISA 一致。
　　 第三部分基于多粘菌素B 吸附作用的免疫传感器
　　 目的：建立基于PMB 吸附作用的新型内毒素免疫传感器。
　　 方法：将一定浓度的PMB固定在已被巯基乙胺和戊二醛修饰的金电极(99.99％，Ф＝4mm）上，封闭后再分别逐次在电极上加入不同浓度的内毒素标准品、抗内毒素兔血清和酶标二抗；在底物为添加2μL 30％的双氧水(H2O2)及含1.0mmol/L 对苯二酚的0.1M pH7.2的PBS 缓冲液中用循环伏安法检测传感器上辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)催化H2O2还原对苯二酚底物产生的电流值，分析内毒素浓度的改变与还原峰峰电流值大小的关系。
　　 结果：免疫传感器法最适检测条件为：PMB 使用浓度 10ug/mL，兔血清稀释倍数1:200，酶标二抗稀释倍数1:100；在大肠杆菌精制内毒素0.001μg/mL～100μg/mL的浓度范围内，还原峰的峰电流值与内毒素浓度成正比，线性范围回归方程为：y=1.386 ln(x)+39，相关系数R2为0.904，最低检测限为1ng/mL。
　　 结论：该免疫传感器建立成功，具有检测范围广，灵敏度高，对内毒素有一定选择性等优点。

目录

文摘

英文文摘

声明

第二部分 多粘菌素B与抗体联用的sELISA法检测内毒素

第三部分 基于多粘菌素B 吸附作用的酶免疫传感器

参考文献

综述:细菌内毒素及其检测技术的进展研究

致 谢