一种凝胶法检测蛋黄卵磷脂中细菌内毒素的方法

摘要

本发明公开了一种凝胶法检测蛋黄卵磷脂中细菌内毒素的方法，包括：蛋黄卵磷脂中细菌内毒素限值L和最小有效稀释浓度c的确定；鲎试剂灵敏度复核；以不同稀释倍数的供试品溶液进行干扰预试验，找出无干扰情况下的最大不干扰浓度，再以该最大不干扰浓度的供试品溶液进行干扰试验；无水乙醇干扰试验；蛋黄卵磷脂干扰试验。本发明的一种凝胶法检测蛋黄卵磷脂中细菌内毒素的方法，通过简单方法准确检测蛋黄卵磷脂中细菌内毒素，供试品溶液的检测可有效排除干扰。

说明书

技术领域

本发明涉及药物分析领域，具体涉及一种凝胶法检测蛋黄卵磷脂中细菌内毒素的方法。

背景技术

细菌内毒素是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素。因此，细菌内毒素广泛存在于自然界中。当内毒素通过消化道进入人体时并不产生危害，但内毒素通过注射等方式进入血液时则会引起不同的疾病。内毒素少量入血后被肝脏细胞灭活，不造成机体损害，内毒素大量进入血液就会引起热原反应，导致发热、白细胞反应、内毒素休克及扩散性血管内凝血等。因此，生物制品类、注射用药剂、化学药品类、放射性药物、抗生素类、疫苗类、透析液等制剂以及医疗器材类(如一次性注射器，植入性生物材料)必须经过细菌内毒素检测试验合格后才能使用。制剂中的细菌内毒素，最大来源为生产用原辅料，因此，生产制剂的原辅料的内毒素水平同样需要监控。

蛋黄卵磷脂为以鸡蛋黄或蛋黄粉为原料，经适当溶剂提取精制而得的磷脂混合物。呈乳白色或淡黄色粉末状或蜡状固体，具有轻微的特臭，是药物制剂中经常用到的辅料，作为乳化剂使用，因此用于注射剂生产的蛋黄卵磷脂，也需要进行细菌内毒素检测。

目前，细菌内毒素检测主要有两种方法，分别为：凝胶法和光度法。凝胶法操作简单，普及程度高，试验条件要求低(37±1℃,60±2分钟)。而光度法，操作相对复杂，普及程度低，试验需要酶标仪等专业的设备。凝胶法因检测方法易操作、准确性好、适用性较强的优势，被各国药典选择作为仲裁试验的方法(当内毒素检测结果出现争议时，以凝胶法结果为准)。

蛋黄卵磷脂呈乳白色或淡黄色粉末状或蜡状固体，不溶于水，也不容易直接被水分散，样品中含有的细菌内毒素无法释放出来。故检测时需要加有机试剂进行溶解，然后用水分散均匀，此时样品中的细菌内毒素溶解于水中，再进行细菌内毒素检测。同时为避免“假阴性”的结果，还需证明该有机试剂不会对蛋黄卵磷脂与鲎试剂的反应存在干扰。目前市面上采用浊度法进行试验(供试品中乙醇浓度应小于20％)，但供试品溶液不澄清透明，用光度法检测结果不准确可靠，且操作复杂，检测成本高。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的缺陷，从而提供一种凝胶法检测蛋黄卵磷脂中细菌内毒素的方法，通过简单方法准确检测蛋黄卵磷脂中细菌内毒素，供试品溶液的检测可有效排除干扰。

本发明提供的一种凝胶法检测蛋黄卵磷脂中细菌内毒素的方法，包括以下步骤：

(1)蛋黄卵磷脂中细菌内毒素限值L和最小有效稀释浓度c的确定；

(2)鲎试剂灵敏度复核；

(3)以不同稀释倍数的供试品溶液进行干扰预试验，找出无干扰情况下的最大不干扰浓度，再以该最大不干扰浓度的供试品溶液进行干扰试验；

(4)无水乙醇干扰试验：第一步验证：无水乙醇中加标准品溶液，用BET水稀释；第二步验证：将无水乙醇稀释，加入不同浓度的细菌内毒素标准溶液，分别制成不同浓度的细菌内毒素标准品的溶液，进行无水乙醇干扰试验检测；

(5)蛋黄卵磷脂干扰试验：将蛋黄卵磷脂溶解于无水乙醇中，取出部分溶液加入分散剂后涡旋，然后用BET水逐步稀释得蛋黄卵磷脂浓度供试品溶液，再加入不同浓度的细菌内毒素标准溶液，分别制成不同浓度的细菌内毒素标准品的溶液，进行蛋黄卵磷脂干扰试验检测。

优选地，所述步骤(1)中蛋黄卵磷脂中细菌内毒素限值L＝2.0EU/g，最小有效稀释浓度c＝15.625mg/ml。

优选地，所述鲎试剂灵敏度为0.03EU/ml。

优选地，所述最大不干扰浓度为15.625mg/ml。

优选地，所述步骤(4)中不同浓度的细菌内毒素标准品的溶液的浓度为2λ、λ、0.5λ、0.25λ。

优选地，所述步骤(5)中溶解条件为在40℃～60℃下水浴加热1～5min后再涡旋30～60min。

优选地，所述步骤(5)中的不同浓度的细菌内毒素标准品的溶液的浓度为2λ、λ、0.5λ、0.25λ。

本发明技术方案，具有如下优点：

本发明提供的凝胶法检测蛋黄卵磷脂中细菌内毒素的方法，通过凝胶法测定蛋黄卵磷脂中细菌内毒素，采用有机试剂进行溶解，然后用水分散均匀，避免“假阴性”的结果，同时通过证明该有机试剂不会对蛋黄卵磷脂与鲎试剂的反应存在干扰，可有效检测蛋黄卵磷脂中细菌内毒素。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

最大有效稀释倍数MVD＝cL/λ，c为供试品溶液的浓度，L为供试品的细菌内毒素限值，λ为在凝胶法中鲎试剂的标识灵敏度(EU/ml)。本申请中，λ为0.03EU/ml；L为2.0EU/g；c＝0.03125EU/ml/2.0EU/g＝15.625mg/ml。

鲎试剂的灵敏度复核试验：本试验中所使用的鲎试剂，已经进行了灵敏度复核，灵敏度为λ＝0.03EU/ml，湛江安度斯生物有限公司。

干扰试验预试验：称取称取蛋黄卵磷脂约250mg，加入少量无水乙醇溶解，用BET水以各稀释倍数的供试品溶液进行干扰预试验，确定无干扰情况下的最大不干扰浓度为15.625mg/ml，以15.625mg/ml浓度的供试品溶液进行干扰试验。

实施例

无水乙醇干扰试验：第一步验证，操作步骤为：用BET水溶解一支细菌内毒素标准品，用旋涡混合器连续混合15分钟，用BET水稀释，每一步至少混合30秒。稀释成4EU/ml(128λ)的标准品溶液。量取无水乙醇0.5ml，加入128λ标准品溶液0.5ml，用BET水逐步稀释至无水乙醇浓度为15.625μl/ml含细菌内毒素标准品2λ的供试品溶液。

无水乙醇干扰试验：第二步验证，操作步骤为：用BET水溶解一支细菌内毒素标准品，用旋涡混合器连续混合15分钟，用BET水稀释，每一步至少混合30秒。依次稀释成0.125EU/ml(4λ)、0.06EU/ml(2λ)、0.03EU/ml(λ)、0.015EU/ml(0.5λ)的标准品溶液。将无水乙醇稀释至浓度为31.25μl/ml，加入不同浓度的细菌内毒素标准溶液，分别制成含2λ、λ、0.5λ、0.25λ细菌内毒素标准品的无水乙醇浓度为15.625μl/ml的供试品溶液，进行无水乙醇干扰试验检测；

取32支已用BET水溶解的鲎试剂32支，0.1ml/支。再分别加入表1制备的溶液(第二步验证)及第一步验证的供试品溶液。将安瓿溶液轻轻混用后封闭管口，在37±1℃无振动保温60±2分钟。

各干扰试验溶液的配制如表1所示。

表1凝胶法干扰试验溶液的制备

结果见表2，溶液C均为阳性，溶液D均为阴性，试验有效；结果表明无水乙醇至少稀释64倍才能不干扰细菌内毒素检测。

表2无水乙醇干扰试验结果

蛋黄卵磷脂干扰试验：称取蛋黄卵磷脂约250mg，加入0.125ml无水乙醇，40℃水浴加热2min，再涡旋30min，使蛋黄卵磷脂完全溶解。取该溶液0.1ml，加0.7ml分散剂后涡旋1min，然后用BET水逐步稀释至蛋黄卵磷脂浓度为31.25mg/ml的供试品溶液(每一步涡旋1min)，再加入0.125EU/ml(4λ)、0.06EU/ml(2λ)、0.03EU/ml(λ)、0.015EU/ml(0.5λ)细菌内毒素标准溶液，分别制成含2λ、λ、0.5λ、0.25λ细菌内毒素标准品的蛋黄卵磷脂浓度为15.625mg/ml的溶液，进行蛋黄卵磷脂干扰试验检测。得到的蛋黄卵磷脂干扰试验结果如表3所示。

表3蛋黄卵磷脂干扰试验结果

以上通过凝胶法可以有效检测到蛋黄卵磷脂中是否含有规定范围内的细菌内毒素标准溶液，保证了蛋黄卵磷脂产品的安全性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。