红豆杉细胞遗传转化体系优化及转基因细胞株ORCA3、MET1-RNAi基因表达分析

摘要

红豆杉细胞大规模培养是最有前景的解决紫杉醇药源途径之一。红豆杉细胞培养过程中紫杉醇含量低而且极不稳定在一定程度上限制其工业化生产。随着紫杉醇生物合成途径的阐明和关键酶及转录因子的克隆，使得通过利用基因工程方法构建高产转基因细胞株成为可能。目前红豆杉细胞遗传转化体系的研究相对较少，本文对根癌农杆菌介导的红豆杉细胞遗传转化进行了系统研究，并获得了系列转基因的细胞株。主要结果如下：
　　 1）植物表达载体构建。首先从长春花和拟南芥中分别克隆到ORCA3和DNA甲级转移酶MET1基因，然后分别构建了ORCA3 植物表达载体和MET1-RNAi 干涉载体，并转化到土壤农杆菌EHA105菌株中。
　　 2）对根癌农杆菌介导的红豆杉细胞遗传转化体系进行优化。
　　 对影响红豆杉细胞遗传转化的主要因素,如菌液浓度、侵染时间、共培养温度和时间等进行了优化，得到最优的转化条件是：选用农杆菌菌株EHA105、以生长状态良好的曼地亚红豆杉悬浮培养细胞为受体材料、菌液光密度OD600=0.6、侵染时间25min、共培养最适温度21℃、共培养时间为48 h；最适的头孢霉素抑菌浓度、潮霉素筛选浓度分别为300 mg/L和8 mg/L。最优的除菌及筛选方式为：用含100mg/L 头孢霉素的无菌水冲洗10 s 共培养结束的细胞材料，然后将材料转至含300mg/L 头孢霉素的抑菌培养基上，两周后转至含150 mg/L 卡那霉素或8 mg/L 潮霉素的筛选培养基上,筛选3个周期可获得转基因细胞株。
　　 3）转基因细胞株ORCA3基因表达分析。对筛选出的阳性细胞进行GUS组织化学活性染色、外源基因的PCR扩增检测和western blot分析，结果表明，外源目的基因已经成功整合到红豆杉基因组中，并在蛋白质水平得到表达；用HPLC 法检测紫杉醇含量，发现转基因细胞株紫杉醇含量变化趋势并不相同，这可能是由插入位点的不同导致的。转基因细胞株紫杉醇的最高含量为159.3 μg/g 干重，为对照组的2.5倍。
　　 4）转基因细胞株MET1-RNAi 载体表达分析。GUS 活性染色和外源基因PCR扩增结果表明，MET1-RNAi 干涉载体已成功转入红豆杉细胞染色体。转基因细胞株紫杉醇的含量都有一定程度的提高，最高含量为178.3 μg/g 干重，为对照组的2.87倍，说明RNAi 重组表达载体在细胞内发挥了生物学作用。

目录

文摘

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声明

1 绪 言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 总结与展望

致 谢

参考文献

附 录