毕赤酵母中FLD1启动子调控解脂耶氏酵母脂肪酶LIP2表达的研究

摘要

解脂耶氏酵母脂肪酶LIP2 (YlLIP2)是一种高活力的脂肪酶，具有重要的工业应用前景。本文克隆了甲醛脱氢酶启动子 (PFLD1)基因，并以pPICZαA质粒为基础构建了带有PFLD1启动子和YlLIP2基因的重组质粒，电转化巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris)X-33获得重组表达菌株。摇瓶发酵筛选高脂肪酶活力的重组子，优化重组工程菌的摇瓶发酵条件，同时在10 l发酵罐上对比了不同诱导策略对脂肪酶YlLIP2表达的影响。主要研究内容和结果如下：
　　 (1)通过PCR方法从P.Pastoris GS115/pPIC9K-Lip2-HIS+中扩增得到PFLD1基因和脂肪酶YlLIP2基因。运用双酶切将 PFLD1启动子替代pPICZαA表达载体上的PAOX1启动子，构建新的表达载体pFZα，然后将脂肪酶YlLIP2基因插入该表达载体，并电转化P.Pastoris X-33，得到重组菌P.Pastoris X-33/pFZα-Lip2。
　　 (2)对重组子进行三次罗丹明B平板筛选，得到308个有橄榄油水解圈的重组子。摇瓶发酵筛选高脂肪酶活力的重组子，得到一株最高活力达672 U/ml的83＃工程菌。对83＃重组子进行了最适碳源和氮源筛选，以甲醇为碳源和诱导物，83＃重组子在诱导72 h后发酵液中酶活力为2,450 U/ml；以山梨醇和甲胺盐酸盐 (MA?HCl)分别作为碳源和诱导物，发酵72 h后酶活力为2,115U/ml。两种培养条件下83＃重组子发酵的YlLIP2酶活力分别是优化前的3.65倍和3.15倍。检测了83＃重组子细胞内的脂肪酶酶活力，为147.86 U/ml，仅为发酵上清的6.4％，而野生菌株X-33胞内只有本底酶活力7.77 U/ml。
　　 (3)10 l发酵罐上对比了MA?HCl和甲醇两种诱导策略。MA?HCl诱导发酵用时75.34 h，最高细胞干重达59.08 g/l，最高酶活达8,400 U/ml，最高蛋白含量为2.2 g/l，最高蛋白质比酶活达3871 U/mg；甲醇诱导发酵用时146.47 h，最高细胞干重达115.73 g/l，最高酶活达15,600 U/ml，最高总蛋白质含量达6.4 g/ l，最高蛋白质比酶活达4,075U/mg。MA?HCl和甲醇两种诱导策略对比发现，前者发酵时间是后者的51.34％，单位时间发酵酶活为111.49 U/(ml·h)，而后者的为108.95U/(ml·h)；前者的单位干细胞酶活力14.79 U/mg，而后者为14.03 U/mg。前者的能耗成本比后者低大约50％。此外，前者发酵所含色素比后者低，更利于后续纯化。
　　 本文研究了PFLD1启动子对毕赤酵母发酵生产脂肪酶YlLIP2的影响，在摇瓶和10 l发酵罐水平均获得很高的表达量，为进一步开发和完善PFLD1启动子诱导表达外源蛋白，以及替代毕赤酵母表达系统中PAOX1启动子奠定了理论基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

1 文献综述

2 PFLD1启动子调控下YlLIP2脂肪酶重组菌的构建

3 高产酶菌株筛选及摇瓶产酶条件优化

4 发酵罐发酵生产YlLIP2脂肪酶的初步研究

5 小结与展望

致 谢

参考文献

附录