结缔组织生长因子在香烟烟雾暴露大鼠肺血管重构中的作用及其与周期蛋白D1的关系

摘要

第一部分结缔组织生长因子和周期蛋白D1在香烟烟雾暴露大鼠肺血管重构中的表达变化
　　 目的：探讨烟雾暴露致大鼠肺血管重构中结缔组织生长因子(CTGF)和周期蛋白D1（cyclinD1）的表达变化及意义。
　　 方法：健康雄性SD大鼠24只，随机分为对照组，烟雾暴露2周、烟雾4周和烟雾暴露8周组，取动脉血检测血氧分压(PaO2)，HE染色和平滑肌细胞α肌动蛋白(α-SM-actin)染色观察肺血管重构，免疫组化观察CTGF和cyclinD1在肺动脉平滑肌中的表达，实时定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测肺动脉CTGFmRNA和cyclinD1mRNA表达，Western Blotting检测CTGF和cyclinD1蛋白表达。
　　 结果：各组大鼠动脉血氧分压均无显著性差异。随烟雾暴露时间延长，肌化血管比例、肺血管壁厚度和血管直径比值（％WT）、CTGF和cyclinD1的mRNA和蛋白表达均呈时间依赖性增加，各组间比较均有显著差异。CTGF与 cyclinD1表达与肺血管壁厚度和血管直径比值（％WT）显著正相关，二者的表达之间也呈显著正相关关系。
　　 结论：烟雾暴露大鼠中，CTGF和cyclinD1表达均随暴露时间（2w~8w）延长而显著上调，二者可能与烟雾暴露致肺动脉平滑肌细胞异常增殖有关。
　　 第二部分结缔组织生长因子在香烟烟雾提取物导致的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用及其和周期蛋白D1的关系
　　 目的：香烟烟雾可以诱导肺血管重构的发生，肺血管重构的特点是肺动脉平滑肌细胞的异常增殖导致的肺动脉中膜增厚。但是，该病理过程的具体机制不明。本研究的目的是探讨结缔组织生长因子是否通过上调肺动脉平滑肌细胞的周期蛋白D1的表达进而调节香烟烟雾提取物诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞的增殖。
　　 方法：原代培养大鼠肺动脉平滑肌细胞，使用不同的CSE浓度（1％，2％，5％，10％）进行孵育，24小时后使用细胞计数方法检测不同CSE浓度对细胞增殖的影响。根据结果，2％CSE对细胞的增殖促进作用最强。将细胞分为5组，正常对照组，2％CSE组，2％CSE+CTGFsiRNA组，2％CSE+NCsiRNA组，2％CSE+cyclinD1siRNA组，各组同步化后转染相关的siRNA，再给予2％CSE孵育。使用细胞计数法和 BrdU检测评价细胞增殖情况。定量PCR检测结缔组织生长因子和周期蛋白D1的mRNA表达水平，western blotting和免疫荧光染色检测结缔组织生长因子和周期蛋白D1的蛋白表的水平。流式细胞术检测细胞周期的分布。
　　 结果：在2％CSE的刺激下，大鼠肺动脉平滑肌细胞的结缔组织生长因子mRNA水平和蛋白水平均升高，并促进细胞增殖。CTGFsiRNA抑制CSE诱导的细胞增殖。此外，CTGFsiRNA明显抑制cyclinD1的mRNA水平和蛋白水平，并导致细胞周期G1期停滞，进而减少大鼠肺动脉平滑肌细胞的增殖。
　　 结论：上述结果表明，结缔组织生长因子促进香烟烟雾提取物诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖，部分原因是其上调周期蛋白D1的表达。
　　 第三部分结缔组织生长因子在香烟烟雾暴露大鼠肺血管重构中的作用及其和周期蛋白D1的关系
　　 目的：香烟烟雾通过诱导肺血管重构导致肺动脉高压，肺血管重构涉及肺动脉平滑肌细胞增殖。结缔组织生长因子是一种富含半胱氨酸的肽，参与多重生物过程，入细胞增殖，细胞迁移。本研究目的是探讨结缔组织生长因子在肺血管重构中的潜在作用。
　　 方法：构建表达shRNA的干扰质粒，降低原代培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞和大鼠肺动脉中的结缔组织生长因子表达。将大鼠肺动脉平滑肌细胞使用香烟烟雾提取物孵育，大鼠分为4组，正常对照组，烟雾暴露组，烟雾暴露加CTGFshRNA干预组，烟雾暴露加阴性对照shRNA干预组，每组6只。烟雾暴露时间为3个月。通过尾静脉注射给予质粒。
　　 结果：CTGFshRNA抑制香烟烟雾诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞中的结缔组织生长因子和周期蛋白D1表达，导致细胞周期G1期停滞，抑制细胞增殖。尾静脉注射CTGF干扰质粒，改善肺血管重构，抑制香烟烟雾诱导的大鼠肺血管结缔组织生长因子和周期蛋白D1表达升高。
　　 结论：表达CTGFshRNA的干扰质粒，可以改善香烟烟雾暴露大鼠的肺血管重构。

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前 言

第一部分 结缔组织生长因子和周期蛋白D1在香烟烟雾暴露大鼠肺血管重构中的表达变化

第二部分 结缔组织生长因子在香烟烟雾提取物导致的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用及其和周期蛋白D1的关系

第三部分 结缔组织生长因子在香烟烟雾暴露大鼠肺血管重构中的作用

综 述

附 录

致 谢