B7-H1/PD-1在人结肠癌中的表达及其与调节性T细胞关系的研究

摘要

本文分二部分：
　　 第一部分：目的：分析B7-H1和PD-1分子在结肠癌组织中的表达水平，并分析结肠癌微环境中异常增高的Treg与B7-H1的关系。
　　 方法：利用Western Blot和流式细胞技术研究结肠癌患者手术切除的癌组织及癌旁正常组织中B7-H1及PD-1的表达情况；使用流式细胞仪检测结肠癌组织及癌旁正常组织中浸润Treg量的差异；使用Western Blot技术检测结肠癌组织中提取的Treg与CD4+CD25-T细胞所表达IL-10的水平差异；免疫磁珠分选健康人外周血中分选的CD4+CD25+和CD4+CD25-细胞进行体外培养并用anti-CD3和anti-CD28刺激，ELISA检测培养体系中IL-10的表达量；免疫磁珠分选人结肠癌中浸润的Treg细胞，与从健康人外周血分选的单核细胞共培养，流式检测单核细胞表达B7-H1的水平；经Treg诱导高表达B7-H1的单核细胞和从结肠癌组织中分选的巨噬细胞与健康人外周血分选的Na(o)ve T细胞共培养，CFSE法测定T细胞的增殖情况，以测定经Treg诱导高表达B7-H1的单核细胞对T细胞的免疫抑制能力。
　　 结果：1．Western Blot结果显示结肠癌患者癌组织及癌旁正常组织均表达B7-H1分子，且癌组织比癌旁正常组织中B7-H1表达水平高；
　　 2．流式细胞仪检测显示B7-H1主要表达于巨噬细胞，且癌组织比癌旁正常组织浸润的巨噬细胞表达的B7-H1的水平高，比例分别为38±4％和5±2％；平均荧光强度（MFI）分别为1900±20和250±100；
　　 3．流式细胞仪检测显示PD-1主要表达于CD8+T细胞，癌组织比癌旁正常组织浸润的CD8+T细胞PD-1的表达水平高，比例分别为51±6％和6±2％；
　　 4．将从结肠癌组织中分选的巨噬细胞分别与健康人外周血分选的经CFSE染色
　　 第二部分：目的：分析B7-H1和PD-1分子在结肠癌组织中的表达水平，并分析结肠癌微环境中异常增高的Treg与B7-H1的关系。
　　 方法：利用Western Blot和流式细胞技术研究结肠癌患者手术切除的癌组织及癌旁正常组织中B7-H1及PD-1的表达情况；使用流式细胞仪检测结肠癌组织及癌旁正常组织中浸润Treg量的差异；使用Western Blot技术检测结肠癌组织中提取的Treg与CD4+CD25-T细胞所表达IL-10的水平差异；免疫磁珠分选健康人外周血中分选的CD4+CD25+和CD4+CD25-细胞进行体外培养并用anti-CD3和anti-CD28刺激，ELISA检测培养体系中IL-10的表达量；免疫磁珠分选人结肠癌中浸润的Treg细胞，与从健康人外周血分选的单核细胞共培养，流式检测单核细胞表达B7-H1的水平；经Treg诱导高表达B7-H1的单核细胞和从结肠癌组织中分选的巨噬细胞与健康人外周血分选的Na(o)ve T细胞共培养，CFSE法测定T细胞的增殖情况，以测定经Treg诱导高表达B7-H1的单核细胞对T细胞的免疫抑制能力。
　　 结果：1．Western Blot结果显示结肠癌患者癌组织及癌旁正常组织均表达B7-H1分子，且癌组织比癌旁正常组织中B7-H1表达水平高；
　　 2．流式细胞仪检测显示B7-H1主要表达于巨噬细胞，且癌组织比癌旁正常组织浸润的巨噬细胞表达的B7-H1的水平高，比例分别为38±4％和5±2％；平均荧光强度（MFI）分别为1900±20和250±100；
　　 3．流式细胞仪检测显示PD-1主要表达于CD8+T细胞，癌组织比癌旁正常组织浸润的CD8+T细胞PD-1的表达水平高，比例分别为51±6％和6±2％；
　　 4．将从结肠癌组织中分选的巨噬细胞分别与健康人外周血分选的经CFSE染色的Na(o)ve T细胞共培养，流式检测发现经诱导高表达B7-H1的单核细胞或结肠癌来源的巨噬细胞组T细胞增殖功能(CFSEdim：30±5％)较对照组(Na(o)ve T细胞单独培养组CFSEdim：63±7％、癌旁正常组织与Na(o)ve T细胞共培养组CFSEdim：55±8％)明显受抑制，阻断B7-H1通路后受抑状态可以得到恢复（加入B7-H1阻断性抗体组CFSEdim：51±10％、加入PD-1阻断性抗体组CFSEdim：54±11％）；
　　 5．流式细胞仪检测显示结肠癌组织中浸润的Treg较癌旁正常组织增多，Foxp3+Treg占CD3+CD4+细胞中的比例分别为18±5％和5±3％；
　　 6．Western Blot检测从结肠癌组织中分选的CD4+CD25+细胞比CD4+CD25-细胞表达的IL-10高；将健康人外周血液中分选的CD4+CD25+和CD4+CD25-细胞分别进行体外培养并用CD3、CD28刺激48小时后，ELISA检测发现CD4+CD25+细胞组表达IL-10的浓度明显高于CD4+CD25-细胞组，浓度分别为180±27pg/ml、52±9pg/ml；
　　 7．分选肿瘤组织中Treg与健康人外周血单核细胞共培养，流式检测发现Treg与单核细胞共培养组B7-H1表达量（比例：28±3％；MFI：1200±80）明显高于对照组（比例：5±1％；MFI：150±20）和加入IL-10拮抗性抗体组（比例：6±2％；MFI：350±50）；
　　 8．将经Treg诱导高表达B7-H1的单核细胞与健康人外周血分选的经CFSE染色的Na(o)ve T细胞共培养，流式检测发现经诱导高表达B7-H1的单核细胞组T细胞增殖功能(CFSEdim：32±8％)较对照组(Na(o)ve T细胞单独培养组CFSEdim：60±7％、外周血未经诱导的单核细胞与Na(o)ve T 共培养组CFSEdim：64±11％)明显受抑制，阻断B7-H1通路后受抑状态可以得到恢复（加入B7-H1阻断性抗体组CFSEdim：52±8％、加入PD-1阻断性抗体组CFSEdim：55±5％）经Treg诱导高表达B7-H1是可以通过B7-H1/PD-1途径抑制T细胞增殖的。
　　 结论：1．结肠癌微环境中巨噬细胞高表达B7-H1；结肠癌组织浸润性CD8+T细胞高表达PD-1；
　　 2．结肠癌微环境中Treg异常增高，且高表达IL-10，结肠癌微环境中Treg可通过高表达IL-10促进巨噬细胞表达B7-H1；
　　 3．结肠癌微环境中B7-H1/PD-1通路可以抑制T细胞的增殖能力，促进结肠癌肿瘤免疫逃逸；
　　 4．阻断B7-H1/PD-1通路可恢复结肠癌微环境中T细胞的增殖能力，干预B7-H1/PD-1通路可能是将来辅助性免疫治疗结肠癌的方法之一。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：略缩词及中英文对照表

声明

一、前言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

五、参考文献

致谢