沉默调节蛋白1(SIRT1)改善高糖诱导的tau蛋白过度磷酸化

摘要

研究背景：
　　SIRT1(silent mating type information regulation2 homolog1)是Sirtuins去乙酰化酶家族中的一员,具有神经保护、抗衰老及延长寿命功能。过度磷酸化tau蛋白聚集形成的神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFTs)是阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)两大病理特征之一。糖尿病患者AD发病的危险性明显增高;AD病人和高糖AD样动物模型,SIRT1蛋白水平及活性的下降与过度磷酸化tau蛋白的聚集呈负相关关系;研究发现SIRT1在海马区神经元祖细胞内高度表达,以上提示SIRT1活性及蛋白水平的降低是高糖导致AD发病危险性增高和tau过度磷酸化的原因,但目前在AD发病过程中的机制仍不清楚。
　　目的：
　　探讨高糖如何引起tau蛋白异常磷酸化和记忆功能损伤及SIRT1在此过程中的作用
　　方法：
　　为探讨高糖如何增加AD患病危险性及内在的机制,以及SIRT1在高糖诱导的AD样病理和功能损伤中的作用,我们选用3月龄、250±20克大鼠,双侧脑室注射链脲佐菌素(Intracerebroventricular-streptozotocin,ICV-STZ)(3mg/kg,两次,间隔48小时),建立高糖AD样动物模型。实验分为三组:1)空白对照组(侧脑室注射生理盐水(Normal saline)ICV-NS+腹腔注射生理盐水ip-NS),2)造模组(ICV-STZ+ip-NS),3)药物干预组(ICV-STZ+腹腔注射白藜芦醇(SIRT1激动剂) i.p-resveratrol)。连续注射8周后,采用免疫印迹方法检测大鼠海马区SIRT1表达量、tau磷酸化程度及与相关激酶酯酶的表达水平;采用相关试剂盒检测SIRT1活性、NAD/NADP比值;采用水迷宫方法检测大鼠空间学习记忆能力。
　　结果：
　　1.STZ诱导tau蛋白过度磷酸化、激活Erk1/2通路和抑制SIRT1活性。
　　免疫印迹实验结果表明,在ICV-STZ8周后,tau蛋白在Thr205、Thr231、Ser396位点过度磷酸化,激活细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,Erk1/2)和下调沉默调节蛋白1(SIRT1)活性。但与tau蛋白过度磷酸化密切相关的激酶糖元合成激酶3(Glycogen synthase kinase-3β,GSK3β),磷酸酯酶2A(Protein phosphatase-2A,PP2A),及丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)途径的两个蛋白激酶C-Jun基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase,JNK),p38均无明显变化。SIRT1活性的下降可能是由于氧化态与还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD/NADH)比值的下降所致。
　　2.在STZ模型中SIRT1活性下降与Erk1/2的过度激活相关。
　　免疫共沉淀(Co-Immuoprecipitation,Co-IP)及免疫印迹(western blot)结果表明,SIRT1与Erk1/2相互结合,且Erk1/2可被乙酰化修饰。提示SIRT1可能通过调节Erk1/2乙酰化水平,从而调控其活性依赖的磷酸化位点的磷酸化,进而调节Erk1/2的活性。
　　3.提高SIRT1活性改善ICV-STZ诱导的学习记忆损伤和tau蛋白磷酸化水平。
　　与造模组相比,药物干预组大鼠予以注射白藜芦醇8周后,空间学习记忆能力明显增强,海马tau蛋白Thr205、Thr231、Ser396位点磷酸化程度显著降低,并伴随SIRT1活性上升、Erk1/2活性下降。
　　结论：
　　1.Erk1/2在STZ模型诱导的tau蛋白异常磷酸化中起重要作用;
　　2.Erk1/2存在乙酰化修饰,且其活性与乙酰化密切相关,SIRT1可能参与Erk1/2的乙酰化修饰;
　　3.提高SIRT1活性抑制tau蛋白的过度磷酸化,并改善大鼠的空间学习记忆能力。

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中文摘要

英文摘要

1 前言

2 材料与方法

2.1 主要试剂和仪器

2.2 实验动物及处理

2.3 免疫印迹

2.4免疫组化（Immunohistochemstry，IHC）

2.5 免疫沉淀（Immuoprecipitation, IP）

2.6 SIRT1活性检测

2.7 NAD/NADH比值测定

3 结果

3.1 STZ诱导ICV-STZ大鼠tau蛋白过度磷酸化

3.2 Erk1/2在ICV-STZ大鼠模型诱导tau蛋白磷酸化起重要作用

3.3 PP2A在ICV-STZ大鼠模型中对tau蛋白磷酸化不起作用

3.4 ICV-STZ大鼠模型诱导海马区SIRT1活性下调

3.5 SIRT1与Erk1/2相互结合且Erk1/2可被乙酰化修饰

3.6 白藜芦醇改善ICV-STZ大鼠空间记忆功能

3.7 白藜芦醇激活SIRT1，降低Tau蛋白磷酸化水平，下调Erk1/2活性

4 小结

5 讨论

SIRT1功能与其家族在神经退行性疾病中的作用

参考文献

附录一 主要英文缩略词表

附录二：硕士期间发表文章

致谢