内皮集落形成细胞在激素性股骨头坏死中作用的研究

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分
　　目的：微循环障碍在激素性股骨头坏死发病机制中起着重要作用,循环内皮祖细胞直接参与血管新生和维持局部血管稳态,其数量和功能的下降与多种疾病状态有关。本文旨在研究激素性股骨头坏死患者外周血中两种内皮祖细胞数量和功能的改变,探讨两种内皮祖细胞在激素导致的内皮功能失调中的作用。
　　方法：选择2008年7月至2010年12月华中科技大学附属协和医院骨科收治33例激素性股骨头坏死患者和33例性别与年龄相匹配的健康人,采集其外周血,从外周血中分离早期内皮祖细胞(早期 EPC)和内皮集落形成细胞(ECFC),分别在铺有人纤维连接蛋白和I型鼠尾胶原的培养板上行体外培养扩增,利用Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)和异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素(FITC-UEA-1)在激光共聚焦显微镜下鉴定两种内皮祖细胞,流式细胞仪检测 CD133和VEGFR2双阳性细胞数量,并检测其集落形成能力、CCK-8试剂盒检测其增殖能力、Transwell小室检测迁移能力、Matrigel基质胶检测成血管能力、ELISA试剂盒检测血管内皮生长因子(VEGF)和基质细胞衍生因子-1(SDF-1)分泌水平。
　　结果：激素性股骨头坏死患者中的两种内皮祖细胞集落形成数目均有所下降(早期EPC集落数:2.42±1.46 vs4.52±2.00, P<0.05;ECFC集落数:0.62±0.55 vs1.12±0.82, P<0.05),早期内皮祖细胞的迁移能力下降(63.8±11.7 vs152.3±12.4, P<0.001),分泌 VEGF因子能力下降(50.8±7.2 pg/ml vs62.8±10.1 pg/ml, P=0.001),内皮集落形成细胞的增殖能力下降(P<0.05),成血管能力下降(7.1±2.7 vs23.8±4.3, P<0.001)。
　　结论：激素性股骨头坏死患者中两种内皮祖细胞的功能在不同方面受损,表明其在激素导致的内皮功能失调中发挥不同作用。
　　第二部分
　　目的：关于内皮祖细胞的一种亚型——内皮集落形成细胞的体外培养扩增及其在组织工程中的应用尚不明确。探索从人脐血中分离培养扩增内皮集落形成细胞并研究其生物相容性,为其作为组织工程种子细胞提供依据。探索体外激素干预对内皮集落形成细胞的细胞因子合成有无影响。
　　方法：采用密度梯度离心法从人脐血中分离单个核细胞,接种于 I型鼠尾胶原包被的培养板上,采用内皮祖细胞专用EGM-2培养基诱导培养,早期传代后扩增, Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1双染及CD31,vWF,KDR和Tie-2免疫荧光鉴定细胞,并检测其体外成血管和增殖能力,与纳米羟基磷灰石/磷酸三钙材料复合培养后观察生物相容性。将内皮集落形成细胞用不同浓度激素(地塞米松0,1uM,1nM)干预下, Western检测细胞内 SDF-1及其受体 CXCR4、以及KDR、Tie-2的表达水平有无差异。
　　结果：脐血来源内皮集落形成细胞呈铺路石样集落生长,吞噬 Dil-Ac-LDL并结合FITC-UEA-1,表达 CD31,vWF,KDR和Tie-2,早期传代后拥有较强增殖潜能,可在体外大量扩增,在体外基质胶上可形成闭合管腔样结构,复合纳米羟基磷灰石/磷酸三钙材料后生物学特性不受影响。地塞米松1uM,1nM对内皮集落细胞的四种因子SDF-1及其受体 CXCR4、以及KDR、Tie-2表达有抑制作用,浓度越高,抑制作用越强。
　　结论：提示可从脐血中分离并体外大量扩增内皮集落形成细胞,脐血来源内皮集落形成细胞适合作为组织工程的种子细胞。地塞米松对内皮集落形成细胞的关键细胞因子表达具有抑制作用。
　　第三部分
　　目的：探讨利用人脐带血来源内皮集落形成细胞在体外培养扩增,局部回输兔早期激素性股骨头坏死模型的股骨头内,观察其呈血管和成骨能力。
　　方法：采用密度梯度离心法从人脐血中分离单个核细胞,接种于 I型鼠尾胶原包被的培养板上,采用内皮祖细胞专用EGM-2培养基诱导培养,早期传代后扩增。选取健康新西兰大白兔35只,经耳缘静脉注射10μg/Kg低剂量的脂多糖内毒素两次,再连续肌肉注射20mg/Kg甲强龙三次,建立兔股骨头坏死模型。四周后,X线,MRI和组织学切片检测造模成功率,将造模成功兔行手术处理,在股骨大转子后下方钻孔,将经过扩增的人脐带血来源的内皮集落形成细胞局部输入,明胶海绵封闭孔道。术后8周取股骨头行组织学检查和显微 CT检测。
　　结果：脐血来源内皮集落形成细胞在体外大量扩增。X线显示造模组兔股骨头软骨下下囊性变,股骨近端骨质疏松,MRI示造模组兔股骨头局部信号异常,组织学见骨细胞陷窝空泡,脂肪细胞增多,部分血管栓塞。治疗组8周后,组织学示新生骨质形成,骨细胞增多,显微 CT示治疗组股骨头形态正常,骨小梁分布均匀,未治疗组股骨头塌陷,骨小梁疏松,断裂。X线示治疗组股骨头形态正常,密度均匀,未治疗组股骨头塌陷变形,骨密度不均匀。
　　结论：小剂量脂多糖联合甲强龙成功诱导兔早期股骨头坏死,脐血来源内皮集落形成细胞在体外经扩增后注入兔股骨头内可促进骨细胞再生,新骨形成,是一种较好的修复骨坏死的方法。

目录

封面

声明

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英文缩略词表（Abbreviations）

第一部分激素性股骨头坏死患者中两种内皮祖细胞的改变

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分内皮集落形成细胞体外扩增、生物相容性及激素干预研究

中文摘要

英文摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分人脐血来源内皮集落形成细胞治疗兔早期激素性股骨头坏死的研究

中文摘要

英文摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

综述 内皮祖细胞与骨再生修复相关研究进展

1 EPCs的分离培养鉴定

2 EPCs的表面标志

3 EPCs与血管新生和修复

4 EPCs与骨再生修复

5 小结与展望

参考文献

附录 攻读博士学位期间发表的文章

致谢