整合素连接激酶在胎盘血管性疾病中的作用研究

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分 ILK在子痫前期发病机制中的作用
　　目的：
　　探讨 ILK在子痫前期患者脐血 EPCs中的表达及其在新生血管形成中的作用。
　　方法：
　　1.分离、培养正常组和子痫前期组脐血 EPCs,利用细胞形态学和免疫荧光吞噬功能(FITC-UEA-I和DiI-ac-LDL)检测鉴定;
　　2.采用逆转录聚合酶链反应检测脐血 EPCs ILKmRNA的表达;
　　3.采用免疫印迹技术检测脐血 EPCs ILK蛋白的表达;
　　4.采用小管形成实验检测 EPCs血管形成能力。
　　结果：
　　1.分离培养单个核细胞,FITC-UEA-I和DiI-ac-LDL双阳性细胞为正在分化的EPCs;
　　2.正常妊娠组 EPCs中ILKmRNA相对吸光度(A)值较子痫前期组显著升高(0.64±0.05与0.45±0.06),子痫前期组轻度者较重度者显著升高(0.47±0.07与0.39±0.08);
　　3.正常妊娠组 EPCs中ILK蛋白 A值较子痫前期组明显升高(32±2与26±1),子痫前期组轻度者较重度者显著升高(25±2与20±2);
　　4.正常妊娠组小管结构形成的数量较子痫前期组显著增多(330±8与135±7),子痫前期组重度者的小管形成的数量明显少于轻度者(148±6与116±8)。
　　结论：
　　子痫前期患者 EPCs中ILKmRNA及其蛋白表达下降可能与子痫前期的发生密切相关。
　　第二部分 ILK对 EPCs与血管形成相关能力的作用
　　目的：
　　研究上调 ILK的表达对 EPCs细胞增殖、迁移和管腔形成能力的影响,了解 ILK在 EPCs形成血管过程中的作用。
　　方法：
　　1.分离、培养重度子痫前期患者脐血 EPCs,将细胞分为实验组(转染 Ad-GFP-ILK)、阴性对照组(转染 Ad-GFP)和空白对照组(不进行细胞转染)3组;
　　2.采用实时荧光定量 PCR技术检测 ILK mRNA的表达;
　　3.采用免疫印迹技术检测 ILK蛋白的表达;
　　4.采用活细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)比色法测定转染后细胞的增殖能力;
　　5.采用Transwell模型迁移实验检测转染后细胞的迁移能力;
　　6.采用重悬贴壁法检测转染后细胞的分化能力；
　　7.采用小管形成实验检测转染后细胞的的管腔形成能力。
　　结果：
　　1.转染后 EPCs中ILK mRNA和蛋白的表达水平,实验组分别为0.831±0.14、0.78±0.12,分别与阴性对照组(分别为0.453±0.21、0.34±0.16)比较,差异均有统计学意义(P<0.05);空白对照组分别为(0.391±0.13、0.41±0.21),分别与阴性对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。
　　2.转染24小时后 EPCs的增殖能力,实验组的积分吸光度(A)值为2.343±0.027,与阴性对照组(1.625±0.033)相比,差异有统计学意义(P<0.05);空白对照组为1.461±0.024,与阴性对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。
　　3.转染24小时后迁移入小室下室的细胞数目,实验组为(138.4±2.6)个,高于阴性对照组(82.6±3.7)个,差异有统计学意义(P<0.05);空白对照组为(95.3±4.2)个,与阴性对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。
　　4.转染24小时后,分化成梭形细胞的数目,实验组为(546.1±6.3)个,阴性对照组为(323.2±3.3)个,空白对照组为(267.4±3.6)个。各组分别比较,实验组与阴性对照组差异有统计学意义(P<0.05);阴性对照组与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)。
　　5.转染24h后,各组 EPCs均未在 Matrigel上形成明显的管腔网络状结构,但实验组形成小管趋势较对照组明显。
　　结论：
　　ILK基因表达水平的升高可以影响 EPCs的增殖、迁移和小管形成能力。
　　第三部分 局部转染 ILK改善 RUPP缺血模型大鼠胎盘灌注
　　目的：
　　通过腺病毒转染技术局部转染模型大鼠胎盘,观察转染 ILK基因后胎盘形态学和微血管密度等方面的变化,探讨 ILK在改善孕鼠胎盘血管生长的可能作用和机制。
　　方法：
　　1.建立孕鼠RUPP缺血模型;
　　2.模型鼠分组,并采用体内腺病毒转染技术将过表达 ILK的载体转染入孕鼠胎盘组织;
　　3.转染后的孕鼠组织行冰冻切片,荧光显微镜下观察 GFP表达以了解病毒的转染效果;
　　4.测量孕17天大鼠转染后胎盘的重量;
　　5.利用实时荧光定量 PCR检测转染后孕鼠胎盘组织 ILK基因的mRNA水平表达;
　　6.利用免疫印迹法检测转染前后孕鼠胎盘组织 ILK基因的蛋白水平表达;
　　7.利用CD34因子免疫组化实验检测孕17天大鼠转染后的胎盘血管密度。
　　结果：
　　1.实验选取的30只孕鼠,麻醉及感染死亡4只,早产1只;
　　2.转染后胎盘组织的冰冻切片在荧光下观察可见 GFP大面积高表达,体内转染效果理想;
　　3.体内转染后,转染组孕鼠的胎盘重量为(0.83±0.12)g,阴性对照组(0.86.±0.23)g,空白对照组(0.79.±0.41)g,转染组与阴性对照组相相比,差异无统计学意义(p>0.05);
　　4.转染后各组胎盘中ILK mRNA的表达水平,转染组为1.352±0.31,阴性对照组为0.757±0.47,空白对照组为0.693±0.46。各组分别比较,实验组与阴性对照组 ILK mRNA的表达差异有统计学意义(P<0.05);阴性对照组与空白对照组 ILK mRNA的表达水平差异无统计学意义(P>0.05);
　　5.转染后各组胎盘中ILK蛋白的表达水平,转染组为0.93±0.45,阴性对照组为0.48±0.32,空白对照组为0.54±0.41。实验组与阴性对照组相比,ILK蛋白的表达差异有统计学意义(P<0.05);阴性对照组与空白对照组相比,ILK蛋白的表达水平差异无统计学意义(P>0.05);
　　6.转染组孕鼠胎盘的微血管数量(78.4±5.03)较阴性对照组(64.2±3.15)显著增多;阴性对照组与空白对照组(60.1±6.34)相比,差异无统计学意义(P>0.05)。
　　结论：
　　利用体内腺病毒转染技术可有效增加 ILK基因在孕鼠胎盘 mRNA和蛋白水平的表达,且能够增强孕鼠胎盘的血管形成能力,提示 ILK有望成为胎盘促血管新生的新靶点。

目录

封面

声明

目录

前 言

参考文献

中文摘要

英文摘要

第一部分 ILK在子痫前期发病机制中的作用

引言

材料和方法

结 果

讨 论

参考文献

第二部分 ILK对EPCs与血管形成相关能力的作用

引 言

材料和方法

结 果

讨 论

参考文献

第三部分 局部转染ILK改善RUPP缺血模型大鼠胎盘灌注

引 言

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

综 述

摘要

前言

一、母胎界面

二、神经轴突导向因子

三、血管内皮祖细胞胞（endothelial progenitor cells，EPCs）

结论

参考文献

附 录

致谢