髓系恶性肿瘤始动细胞拮抗氧化应激诱导的细胞衰老的实验研究

摘要

第一部分不同危险程度骨髓增生异常综合征患者CD34+细胞差异性表现衰老特征
　　目的:评估骨髓增生异常综合征(MDS)患者CD34+细胞的衰老表现和程度,探讨这种衰老现象与氧化应激-DNA损伤-p38MAPKα(p38)信号通路激活的关系。
　　方法:从47例MDS患者,14急性髓系白血病(AML)患者和12例健康志愿者的骨髓细胞中分选出CD34+细胞,检测衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色和细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子p21CIP1/WAF1(p21)的表达水平来评价这群细胞的衰老表现,分别用流式细胞术、细胞免疫荧光、蛋白免疫印迹(Western Blot)检测细胞内活性氧簇(ROS)、DNA双链断裂标志物γ-H2AX和p38的表达水平。
　　结果:与正常对照相比,不论是骨髓单个核细胞(BMMNCs)群体还是CD34+细胞,SA-β-gal染色阳性细胞数比例和p21的基因表达在相对低危组(lower-risk)MDS组均明显增高(P<0.01),SA-β-gal染色阳性细胞数比例与患者国际预后积分系统(IPSS)呈负相关;ROS积聚和γ-H2AX阳性细胞比例在BMMNCs、CD34+细胞水平各组之间无统计学差异,但两者在CD34+CD38-细胞水平呈相互关联性升高(P<0.05),对照组　　结论:在包含干/祖细胞或MDS始动细胞的CD34+细胞群体,MDS相对低危组患者有明显增多的衰老细胞,这在无效造血或抵抗转化白血病方面可能起到一定作用,而此作用不完全依赖于ROS-p38信号通路;而MDS相对高危组患者的CD34+细胞没有明显衰老表现,表明其突破了阻碍其向AML转化的衰老屏障。
　　第二部分P38MAPKα低水平磷酸化阻碍髓系白血病CD34+CD38-细胞氧化应激诱导的细胞衰老
　　目的:研究髓系白血病CD34+CD38-细胞内活性氧簇(ROS)-DNA损伤-P38MAPKα(p38)-细胞衰老这一在造血干细胞(HSCs)中的经典应激性衰老通路的信号分子激活情况。
　　方法:从11例急性髓系白血病(AML)患者、9例慢性髓系白血病(CML)慢性期患者骨髓单个核细胞和KG1a、K562细胞系中分选出CD34+CD38-细胞,比较它们与正常脐血CD34+CD38-细胞的ROS-DNA损伤-p38-细胞衰老信号通路激活情况。以KG1a、K562细胞系的CD34+CD38-细胞为研究对象,异常激活p38,观察它们的细胞增殖、周期、衰老、凋亡的变化。
　　结果:髓系白血病患者和KG1a、K562细胞系CD34+CD38-细胞的ROS聚积和DNA双链断裂标志物γ-H2AX水平明显高于正常脐血HSCs和用H2O2刺激而诱导衰老的脐血HSCs,而p38的磷酸化水平却相对不足;迫使KG1a、K562细胞系CD34+CD38-细胞的p38高水平磷酸化后,细胞发生衰老样改变、细胞周期阻滞和凋亡。
　　结论:在包含髓系白血病始动细胞的CD34+CD38-群体中,p38磷酸化水平的相对不足,是解联细胞内ROS聚积诱导细胞衰老和/或凋亡的重要原因。
　　第三部分MicroRNA-34c诱导髓系白血病CD34+CD38-细胞衰老样改变
　　目的:研究miR-34c在髓系白血病CD34+CD38-细胞中的表达,它是否能诱导细胞衰老,是否受ROS-p38信号调控及其在髓系白血病发生发展中的作用。
　　方法:从11例急性髓系白血病(AML)患者、9例慢性髓系白血病(CML)慢性期患者骨髓单个核细胞和KG1a、K562细胞系中分选出CD34+CD38-细胞,用实时定量RT-PCR检测miR-34c的表达水平;用p38激活剂使KG1a、K562细胞系CD34+CD38-细胞的p38高水平磷酸化,观察miR-34c表达水平的变化;用miR-34c的类似物转染KG1a、K562的CD34+CD38-细胞,使其高水平表达miR-34c,观察细胞增殖、周期、衰老、凋亡的变化和其下游靶蛋白的表达水平变化;运用KG1a-AML-NOD/SCID小鼠模型,通过观察小鼠的体重变化,生存状态、肿瘤负荷,研究miR-34c在AML发生发展中的作用。
　　结果:与正常脐血CD34+CD38-细胞相比,髓系白血病患者和KG1a、K562细胞系CD34+CD38-细胞的miR-34c的表达明显下降;KG1a、K562细胞系CD34+CD38-细胞的miR-34c表达随p38的磷酸化而增强;转染miR-34c类似物后,通过下调多种下游靶蛋白(e2f3,cyclin-E,c-myc,CDK4)使KG1a、K562细胞系CD34+CD38-细胞呈现衰老样改变和细胞凋亡;miR-34c类似物注入KG1a-AML-NOD/SCID小鼠模型后能使小鼠的生存时间延长,肿瘤负荷减轻,从而阻碍AML的发生发展。
　　结论:miR-34c是诱导髓系白血病CD34+CD38-细胞衰老样改变的重要小分子,它在髓系白血病中的低水平表达是白血病始动细胞突破细胞衰老屏障的重要原因。

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封面

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前言

中文摘要

英文摘要

第一部分 不同危险程度骨髓增生异常综合征患者CD34+细胞差异性表现衰老特征

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 P38MAPKα低水平磷酸化阻碍髓系白血病CD34+CD38-细胞氧化应激诱导的细胞衰老

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 MicroRNA-34c诱导髓系白血病CD34+CD38-细胞衰老样改变

结果

讨论

参考文献

结论

综述

癌基因诱导的细胞衰老的实验证据

细胞衰老是癌前病变的特征之一

细胞衰老是抑制肿瘤进展的机制之一

癌基因的激活水平决定是否发生癌基因诱导的衰老

肿瘤抑制因子在癌基因诱导衰老中的作用

诱导细胞衰老是抗肿瘤治疗的新策略

参考文献

英文缩略词表

附录

致谢