肝脏TCRγδ+CD3+CD4-CD8-T细胞在小鼠病毒性肝炎中的作用及其作用机制

摘要

研究背景及目的：
　　病毒性肝炎以肝细胞损伤为主要特征,然而肝细胞损伤的具体机制尚未完全明确。目前大部分学者认为肝炎病毒本身并不直接造成肝细胞的损伤,而机体抗肝炎病毒的免疫反应,特别是免疫细胞介导的免疫反应,是造成肝细胞损伤的主要原因。多种免疫细胞亚群,如CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤细胞(NK)、NKT细胞、调节性 T细胞、巨噬细胞等,都被证实在这一病理过程中发挥重要作用。近年来随着对肝炎发病机制研究的深入,越来越多的研究表明非特异性免疫反应,特别是 NK细胞和巨噬细胞介导的非特异性免疫反应,也参与了病毒性肝炎感染引起肝脏损伤的发病机理。我们对 HBV诱导的暴发型肝衰竭(FHF)和慢加急性肝衰竭(HBV-induced acute-on-chronic liver failure, HBV-ACLF)研究后发现,肝脏 NK细胞通过死亡受体途径 Fas/FasL和NK细胞受体配体识别途径 NKG2D/NKG2DL对肝细胞造成损伤。在3型鼠肝炎病毒(MHV-3)诱导的小鼠暴发性肝衰竭中活化的巨噬细胞能够分泌炎性因子 TNF, IL-1进一步促进肝脏中的炎症反应并加重肝细胞损伤。此外,活化的巨噬细胞还分泌促凝血活性物质 fgl2凝血酶原酶(fibrinogen like protein2), fgl2凝血酶原酶可以激活凝血级联反应,引起肝脏微循环障碍并导致肝细胞大块死亡。因此明确各种免疫细胞及其分泌的细胞因子形成的免疫网络在病毒性肝炎引起肝细胞损伤中的作用将有助于更加全面的认识病毒性肝炎的发病机制,并为其临床诊断和治疗提供重要的靶点。
　　近年研究发现,机体存在一种新型 T细胞亚群——CD3+CD4-CD8-细胞(双阴性 T细胞,DN T)。在健康人群和正常小鼠外周血 T细胞中,DNT细胞所占比例为1–5％。随着对 DN T细胞的深入研究,越来越多的证据表明 DNT细胞在多种疾病,如移植排斥、自身免疫性疾病、肿瘤免疫、感染性疾病、过敏性疾病以及移植物抗宿主病等疾病的病理进程中发挥重要作用。在不同的疾病中DN T细胞表达不同的表面标志细胞,分泌独特的效应因子,通过这些效应因子发挥其生物学功能。在器官移植模型中,将脾细胞来源的DN T细胞克隆后输入小鼠体内,DN T细胞能够通过 Fas/Fasl、穿孔素等途径杀伤抗供者 CD4+T细胞、CD8+T细胞和B细胞,从而提高移植物的存活时间和存活率。Zhang, Z等通过对 MRL/lpr小鼠模型中DNT细胞研究后发现,系统性红斑狼疮模型鼠(MRL/lpr)中DNT细胞高表达 IL-17和IL-23R,并且与疾病进程及严重程度呈正相关。在感染土拉热弗郎西丝菌(Francisella tularensis)的小鼠中,研究发现感染后肺组织中DN T细胞可以分化为两个亚群,一群主要分泌 IL-17,而另一群以分泌 IFN-γ为主,并在疾病进程中发挥不同的生物学作用。Lis R.V等研究发现利什曼原虫感染者外周血 TCRαβ+DNT(TCRαβ+CD4-CD8-)细胞可以分泌炎性细胞因子IFN-γ和TNF-α,而TCRγδ+DNT(TCRγδ+CD4-CD8-)主要分泌调节性细胞因子 IL-10。
　　迄今,肝脏 DN T细胞是否在病毒性肝炎中发挥作用尚不明确。本实验室以鼠3型肝炎病毒(MHV-3,murine hepatitis virus3)感染 C3H/Hej小鼠成功建立了小鼠病毒性肝炎模型,本研究拟利用MHV-3诱导的小鼠病毒性肝炎模型,探讨 DN T细胞在病毒性肝炎发生发展中的作用。具体研究目标如下:
　　1.研究在病毒性肝炎模型小鼠肝脏中DN T细胞 TCRγδ+ DN T细胞亚群和TCRαβ+DN T细胞亚群的比例。在疾病进程中动态观察病毒性肝炎模型小鼠肝脏 TCRγδ+DN T细胞比例、数量。
　　2.鉴定肝脏 TCRγδ+ DN T细胞的表面标志和细胞因子谱。
　　3.探讨肝脏 TCRγδ+ DN T细胞细胞对肝细胞的损伤作用及机制。
　　研究方法：
　　1.MHV-3腹腔感染途径建立小鼠病毒性肝炎模型。流式细胞术检测正常和感染MHV-310天后模型小鼠肝脏 DNT表达 TCRγδ+和TCRαβ+的比例。动态观察MHV-3感染0、3、7、10、15、20、30天后模型小鼠肝脏 TCRγδ+DN T细胞在肝脏 T细胞中比例变化及其绝对计数。
　　2.流式细胞术检测感染 MHV-310天的C3H/Hej小鼠肝脏 TCRγδ+DN T细胞表达表面标志 CD30、 CD25、CD28和CD44的百分率、感染 MHV-3后各时间点肝脏TCRγδ+DN T细胞表达活化标志 CD69分子的百分率。采用细胞因子染色法检测肝脏 TCRγδ+DN T细胞分泌 IL-2、 IL-4、 IL-10、IL-17A、IL-21、IL-22、肿瘤坏死因子-α(TNF-α,tumor necrosis factor-α)、γ-干扰素(interferon,IFN-γ)、穿孔素(perforin)和颗粒酶 B(granzyme B)的水平。采用α-GalCer:mCD1d二聚体来鉴定肝脏 TCRγδ+DN T细胞与 NKT细胞之间的关系。
　　3.体外实验:磁珠分选肝脏 TCRγδ+DN T细胞。胶原酶原位灌流消化法分离小鼠原代肝细胞。以感染 MHV-310天的C3H/Hej小鼠肝脏 TCRγδ+DN T细胞为效应细胞,肝细胞为靶细胞,采用非放射性细胞毒实验检测肝脏 TCRγδ+DN T细胞在体外对正常或感染 MHV-3的原代肝细胞的杀伤活性。采用Transwell法检测肝脏 TCRγδ+DN T细胞对肝脏细胞的杀伤作用是否依赖细胞与细胞间的接触。在体外,通过抗体阻断 TNF-α, IFN-γ和IL-17A检测肝脏 TCRγδ+ DN T细胞杀伤肝细胞的作用途径。
　　4.体内实验:将磁珠分选纯化的肝脏 TCRγδ+ DN T细胞经尾静脉被动转移过继到MHV-3感染5天后 C3H/Hej小鼠体内(3×106/只),同体积 PBS液尾静脉转移过继到 MHV-3感染5天后 C3H/Hej小鼠体内作为对照,观察两组生存曲线、转移过继3天后各组外周血 AST和ALT水平、肝脏组织 H-E染色。
　　结果：
　　1.在正常小鼠和MHV-3诱导的小鼠病毒性肝炎模型中,肝脏DN T细胞以TCRγδ+ DN T细胞亚群为主。在感染 MHV-3后各时间点肝脏 TCRγδ+DN T在肝脏 T淋巴细胞中的比例较感染前显著升高,在感染后10天达到最高值(19.7±3.22％);肝脏TCRγδ+DN T细胞数量在 MHV-3感染后显著增加,在感染后10天达到最高峰(6.51±1.29×105)。
　　2.流式细胞术检测 MHV-3诱导的小鼠病毒性肝炎模型中肝脏 TCRγδ+DN T细胞的表面标志为 TCRγδ+ CD3+ CD4- CD8- CD25- CD28- CD30- CD44+。肝脏 TCRγδ+DNT细胞不能特异性识别α-半乳糖酰基鞘氨醇,表明这群细胞不属于 NKT细胞亚群。在感染 MHV-3后,随着病程进展,肝脏 TCRγδ+DNT表面活化标志 CD69分子表达水平持续升高,在感染后10天达到最高水平(83.45±5.32％)。模型中肝脏TCRγδ+DN T表达 TNF-α、INF-γ、IL-17A和IL-2,几乎不表达 IL-4、IL-10、IL-21、IL-22、FasL、穿孔素(perforin)和颗粒酶 B(granzyme B)。
　　3.体外实验:MHV-3诱导的病毒性肝炎小鼠模型中,感染后肝脏 TCRγδ+DN T细胞对染后肝细胞有明显的杀伤作用。通过 Transwell实验发现,肝脏 TCRγδ+ DN T细胞对感染后肝细胞的直接杀伤作用不需要细胞与细胞间的接触。通过抗体阻断试验证明,阻断 TNF-a后肝脏 TCRγδ+DN T细胞对感染后肝细胞的杀伤作用显著降低,而单独阻断 IFN-γ或 IL-17A后肝脏 TCRγδ+DNT细胞对感染后肝细胞的杀伤作用无显著改变。
　　4.体内实验:将感染 MHV-310天后小鼠病毒性肝炎模型中肝脏 TCRγδ+DNT细胞过继给感染 MHV-35天后小鼠病毒性肝炎模型小鼠,小鼠生存率显著降低,从41.7％下降至8.33％。在过继3天后,肝脏 TCRγδ+ DN T细胞转移过继组小鼠血清 ALT和AST水平较 PBS过继对照组显著升高;在过继3天后,肝脏 TCRγδ+ DN T细胞转移过继组肝脏病理损伤较 PBS过继对照组更加明显,出现肝细胞水肿、气球样变、点状坏死、灶状坏死,甚至碎片状坏死,并伴有大量淋巴细胞浸润。
　　结论：
　　1.本研究首次利用MHV-3诱导的小鼠病毒性肝炎模型探讨了肝脏 TCRγδ+ DN T细胞在病毒性肝炎中的作用。研究发现小鼠病毒性肝炎模型中肝脏 TCRγδ+DNT细胞具有独特的表面标志。这群细胞不属于 NKT细胞亚群。在感染 MHV-3后,肝脏TCRγδ+DNT细胞的数量大量增加并且大量活化,表达细胞因子 TNF-α、IFN-γ、IL-17A和IL-2。
　　2.MHV-3诱导的病毒性肝炎小鼠模型中,感染后肝脏 TCRγδ+DNT细胞对感染后肝细胞有显著的杀伤作用。这种杀伤作用不依赖细胞和细胞间的接触。通过抗体阻断实验证明肝脏 TCRγδ+DNT细胞主要是通过 TNF-a对感染肝细胞发挥细胞毒作用。
　　3.将肝脏 TCRγδ+DNT细胞转移过继到病毒性肝炎小鼠体内后能够加重病毒性肝炎小鼠病情发展,导致小鼠生存率降低。
　　4.本研究证明在小鼠病毒性肝炎模型肝脏中存在一群 TCRγδ+DNT细胞,参与了小鼠病毒性肝炎的发生发展,与肝脏损伤密切相关。这一研究发现有助于深入理解病毒性肝炎的发病机制并且可能为临床诊断和治疗提供一些新的参考。

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声明

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中文摘要

英文摘要

第一部分 小鼠病毒性肝炎模型的建立及肝脏DN T细胞数量的动态观察

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

第二部分 小鼠病毒性肝炎模型中肝脏TCRγδ+DNT细胞的表型鉴定及细胞因子的表达

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

第三部分 小鼠病毒性肝炎模型中肝脏TCRγδ+DNT细胞对肝细胞的损伤作用及作用机制

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

全文小结

综 述

1. DNT细胞的来源

2. DNT细胞的分子学特征

3. DNT细胞与疾病的关系

4.展望

参考文献

附录1

附录2

致谢