基于存在形式的人精浆游离mRNA和microRNA提取

摘要

第一部分基于存在形式的人精浆游离mRNA提取
　　实验一基于存在形式的人精浆游离mRNA提取方法
　　背景与目的:本小组在前期研究中,已发现绝大部分精浆游离mRNA(cell-freeseminalmRNA,cfs-mRNA)存在于精浆小体中,从而保护不被精浆RNA酶降解。由于精浆小体直径大部分在0.10μm以上,本实验拟采用0.10μm滤膜对精浆标本微过滤(microfiltration,MF)截留大部分精浆小体,用于提取cfs-mRNA,检测这种基于存在形式的提取方法的提取量,同时也是对cfs-mRNA的存在形式进行证实性研究。
　　方法:收集精液参数正常的男性精液标本,用0.10μm滤膜过滤后用TrizolLSReagent提取cfs-mRNA,通过荧光定量RT-PCR,扩增管家基因β-actin(ACTB)、睾丸组织特异基因DDX4、PRM2、附睾特异性表达基因WFDC9、前列腺特异基因TGM4、精囊腺特异基因SERPINA5,与不过滤直接应用TrizolLSReagent提取cfs-mRNA比较,分析0.10μm滤膜对cfs-mRNA提取含量的影响。
　　结果:将正常男性精浆标本通过0.10μm滤膜后再采用TrizolLSReagent提取cfs-mRNA,与未过滤提取的mRNA比较,分别有93.9％±15.7%(Mean±SE)ACTB、99.1%±12.5%DDX4、76.9%±18.5%PRM2、88.1%±29.6%WFDC9、150.2±73.6%TGM4、98.6%±17.8%SERPINA5被提取,各基因水平均无明显降低(P>0.05,n=6,Paird-Samplest-test)。说明大部分含cfs-mRNA的精浆小体被0.1μm滤膜截留下来,滤膜上精浆小体内cfs-mRNA足以稳定被检测出。
　　结论:利用0.10μm滤膜对精浆小体进行富集,进而再提取cfs-mRNA,这种基于存在形式的提取方法,不会对cfs-mRNA量产生明显降低,因此可有效的提取cfs-mRNA。且本实验结果与前期课题组对通过精浆小体的获取及过滤实验等结果一致,表明大部分精浆小体不能通过0.10μm滤膜,同时证实cfs-mRNA主要被包裹在精浆小体中。
　　实验二提取精浆mRNA的质量分析
　　背景与目的:以上实验表明,基于存在形式的提取所获得的cfs-mRNA产量无明显损失,且操作简便,具有可行性。另一方面,精浆成分复杂,经滤膜过滤后,应可以避免一些成分对提取RNA的影响,而提高RNA的质量。本部分实验主要分析经滤膜过滤后所提取的cfs-mRNA的纯度和DNA污染等。
　　方法:分别通过未过滤直接用TrizolLSReagent提取方法,和微过滤(microfiltration,MF,直径0.1μm)后TrizolLSReagent对留于滤膜上的精浆小体进行裂解提取的方法,提取cfs-mRNA。通过分光光度计测定两种方法提取的mRNA纯度(OD260/280);通过毛细血管电泳对所提取的RNA片段分布进行分析;荧光定量PCR扩增DDX4,定量检测两种方法提取的cfs-mRNA中基因组DNA的残留量。提取滤膜上及滤液中的DNA,荧光RT-PCR定量检测DNA残留量,并与精浆DNA总量进行比较。
　　结果:联合应用0.1μm滤膜和TrizolLSReagent的提取方法所提取的RNA,OD260/280为1.828±0.021(n=6),与TrizolLSReagent提取的RNA(1.570±0.042)相比,纯度明显提高(P<0.05,Paird-Samplest-test)。毛细管电泳片段分布说明微过滤后500nt以上的cfs-mRNA较未过滤组相对量有所提高。荧光定量PCR检测RNA中DNA浓度为15.5±10.3ng/ml,与未过滤精浆提取RNA中DNA(浓度216.4±95.2ng/ml)相比,残留量明显减少(P<0.05)。且通过对滤膜上和滤液中精浆DNA提取发现,DNA绝大部分通过0.1μm滤膜存在于过滤后的滤液中。将未过滤精浆中的DNA量设为1,微过滤后滤膜的DNA量仅为14.4%,而滤液DNA量为未过滤精浆组的162.6%。
　　结论:联合应用0.10μm滤膜和TrizolLSReagent可高效富集cfs-mRNA,提取效果明显改善。0.10μm滤膜过滤精浆标本时大量DNA通过,从而更有利于提取滤膜之上游离mRNA,获得的mRNA纯度更高、DNA残留量更少。该方法可作为可靠cfs-mRNA提取技术,为后续microarray、northern-blot、RT-PCR等技术需求提供较好的方法基础。
　　第二部分基于存在形式的人精浆游离microRNA提取
　　实验一基于存在形式的人精浆游离microRNA提取方法
　　背景与目的:本小组前期研究中,已发现绝大部分精浆游离microRNA(cell-freeseminalmicroRNA,cfs-miRNA)并非和mRNA一样存在于小体中,而主要可能以蛋白复合物形式存在,且这种复合物颗粒直径小于0.10μm。因此本实验旨在将精浆通过微过滤(microfiltration,MF,直径0.10μm)与超滤(ultrafiltraton,UF,分子量30kDa)双重过滤后,对蛋白浓缩液进行游离microRNA的提取,检测这种基于cfs-miRNA存在形式的提取量。同时是对cfs-miRNA存在形式的证实性研究。
　　方法:收集精液参数正常的男性精液标本,应用0.10μm滤膜微过滤精浆,将滤液通过30kDa蛋白超滤,对蛋白进行浓缩后提取cfs-miRNA,通过荧光定量RT-PCR扩增各生殖腺体特异表达或丰度较高的miR-30d、miR-93、miR-202、miR-514、miR-891b、miR-892a、miR-141、miR-221,与应用TrizolLSReagent提取方法比较,分析0.10μm滤膜微过滤和蛋白超滤对cfs-miRNA提取含量的影响。
　　结果:将正常男性精浆标本通过0.10μm滤膜后,对滤液进行蛋白浓缩,再采用TrizolLSReagent提取cfs-miRNA,与未过滤直接提取方法比较,各microRNA水平均无明显降低,分别有119.1%±57.2%miR-30d,165.1%±62.3%miR-93,108.6%±23.3%miR-202,126.7%±45.4%miR-514,163.4%±88.0%miR-891b,142.1%±54.6%miR-892a,129.7%±59.9%miR-141,94.9%±13.2%miR-221被提取出。表明cfs-miRNA颗粒直径小于0.10μm,可被30kDa孔径大小的蛋白浓缩柱截留以及浓缩后,microRNA足以被稳定检测。
　　结论:通过超滤(分子量30kDa)蛋白浓缩离心可将含cfs-miRNA的蛋白复合颗粒富集,通过该方法提取的cfs-miRNA无明显降低(P>0.05),此种基于其存在形式的方法,可有效的提取cfs-miRNA。同时也证实了cfs-miRNA确实以蛋白形式存在,且蛋白复合颗粒直径小于0.10μm。
　　实验二提取精浆microRNA的质量分析
　　背景与目的:从本部分实验一的研究中,我们发现基于microRNA存在形式,利用微过滤以及超滤对蛋白浓缩后,对蛋白浓缩液提取的cfs-miRNA的量无明显降低。那么,这种方法是否会提高miRNA的质量呢?本部分实验将对其质量改善与否进行进一步检测。
　　方法:将精液参数正常的男性精浆,通过0.10μm滤膜微过滤,取滤液进行蛋白超滤离心管离心,对存于离心管膜上的蛋白浓缩液通过TrizolLSReagent裂解提取cfs-miRNA,采用毛细血管电泳对所提取RNA进行片段分布的分析;通过荧光定量PCR扩增DDX4,定量检测提取的cfs-miRNA中DNA基因组的残留量,与采用TrizolLSReagent提取精浆游离总RNA中DNA基因组残留量进行比较。且对超滤离心管膜上蛋白浓缩液及离心管滤液中的精浆标本进行DNA提取,荧光定量PCR定量检测DNA(DDX4)量,与未做任何处理提取的精浆DNA总量进行比较,分析超滤离心管对DNA的影响。
　　结果:对超滤离心管中和超滤液中精浆DNA提取发现,DNA与cfs-miRNA一样,大部分存在于超滤离心管中。将未过滤精浆提取DNA量设为1,则超过滤后滤液中提取DNA量为0.8%,超滤管中DNA量为237.0%。尽管如此,我们通过微过滤以及超滤后提取cfs-miRNA后,荧光定量PCR检测RNA中DNA浓度为176.5±110.4ng/ml,与未过滤RNA中DNA(浓度281.9±159.9ng/ml)相比,残留量仍明显减少。毛细管电泳片段分布分析提示超滤后,小于200nt的RNA相对量有所提高。
　　结论:联合应用0.10μm滤膜微过滤和超滤离心管可高效富集cfs-miRNA,获得miRNA中DNA基因组残留量明显减少,提取效果明显改善。该方法可作为可靠cfs-miRNA提取技术,为后续研究提供可靠基础。

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中文摘要

英文摘要

前言

第一部分 基于存在形式的人精浆游离mRNA提取

实验一 基于存在形式的人精浆游离mRNA提取方法

材料与方法

结果

讨论

参考文献

实验二 精浆游离mRNA提取的质量分析

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 基于存在形式的人精浆游离microRNA提取

实验一 基于存在形式的人精浆游离microRNA提取方法

材料与方法

结果

讨论

参考文献

实验二 提取精浆游离microRNA的质量分析

材料与方法

结果

讨论

参考文献

实验小结

综述

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致谢