AGGF1在斑马鱼胚胎血管发育中的关键作用及机制研究

摘要

多于70余种疾病与血管发育异常有关。以血管发育为治疗靶点,包括抗抑制血管和促血管治疗等已经成为诸如癌症、心血管疾病和黄斑退化等常见疾病的新兴治疗手段。然而,我们对于血管发育的过程以及其分子调控机制了解还不完全。动脉和静脉血管是血管系统发育过程中最早形成的重要部分,它们对于胚胎和成体都具有重要的作用,但它们之间在结构和功能上却又不尽相同。动脉血管形成过程中,血管内皮细胞生长因子-A(VEGF-A)通过Notch信号通路调控动脉内皮细胞的分化。研究也发现了调控静脉血管分化的因子,但对于其分子作用机制还了解的不是十分的清楚。AKT信号分子被发现通过抑制Raf-MEK1/2-ERK1/2信号对于静脉血管的分化起重要作用。转录因子COUP-TFII也调控静脉血管的发育,但与AKT的关系还未确定。与迄今为止,还没有研究发现调控静脉内皮细胞分化的血管生成因子。
　　Klippel-Trenaunay综合征(KTS)是一种先天性血管疾病,主要病症表现为毛细血管畸形、静脉血管畸形、静脉曲张并伴随有患病组织肥大。虽然已有KTS遗传家系报道,但大多数的KTS患者还多为偶发病例。研究证实KTS患者中出现诸如染色体易位以及18号染色体超数环等染色体突变,说明遗传因素是KTS重要致病原因。前期通过对KTS患者研究发现,在5号和11号染色体上出现了易位,从而发现了一个新的血管生成因子AngiogenicfactorwithGpatchandFHAdomains1(AGGF1)。
　　人类AGGF1定位于5q13.3,其所编码的蛋白质在N端有coiled-coil和OCRE结构域,C端具有forkhead-associateddomain(FHA)和G-patch结构域,但这些结构域的功能还未了解的十分清楚。AGGF1可以分泌到内皮细胞外,纯化的AGGF1蛋白可以促进内皮细胞管的形成。在鸡胚绒毛尿囊膜实验中,AGGF1可以促进血管生成,并且在缺氧的情况下,AGGF1的表达升高。最近的研究发现,AGGF1的转录水平受到转录因子GATA1调控。GATA1特异siRNA可以降低AGGF1的表达,导致内皮细胞凋亡,阻碍内皮细胞迁移和毛细血管形成。AGGF1在体内是否与血管生成有关;以及其调控血管生成的细胞信号通路与分子机制还完全未知。
　　本研究以斑马鱼为研究对象,通过干扰和过表达AGGF1等实验手段,研究该血管生成因子在胚胎发育过程中的生理学作用。主要结果如下:
　　AGGF1基因在斑马鱼发育早期就开始表达,在24hpf和48hpf阶段其主要在脑部和中枢神经细胞中表达;而在成鱼的脑,眼,心脏等器官中也均有表达。
　　在Tg(kdrl:GFP)la116胚胎中注射AGGF1吗啡啉寡核苷酸,体节间血管和肠下血管以及静脉血管发育产生缺陷。
　　斑马鱼胚胎中过量表达AGGF1可以诱导血管生成,并增加静脉血管直径。AGGF1过量表达胚胎中,静脉内皮细胞特异表达基因flt4的表达量升高,动脉特异表达标志基因notch5表达基本未受影响。
　　整体原位杂交动静脉特异表达标记基因结果显示,在AGGF1敲降胚胎中,动脉血管发育正常,静脉血管发育出现缺陷。AGGF1基因对于斑马鱼胚胎发育过程中的动-静脉血管分化具有重要作用。AKT信号通路在静脉血管发育过程中起重要作用。为探讨AGGF1影响静脉血管发育的分子机制,我们首先分析了AGGF1对AKT磷酸化水平的影响。Westernblot结果显示:胚胎敲降了AGGF1后抑制AKT的活性,而注射AGGF1mRNA则会激活AKT的活性。通过AKTmRNA回补实验,AKT的过量表达可以恢复AGGF1基因表达缺失引起的静脉血管发育缺陷。在静脉内皮细胞分化过程中,AGGF1处于AKT的上游。
　　本研究揭示新血管生成因子AGGF1通过AKT信号通路调控静脉血管分化。由于AGGF1特异对毛细血管和静脉血管分化起作用,这解决了困扰人们100多年,KTS患者为何主要为毛细血管和静脉血管受影响,而动脉血管基本不受影响的疑问。

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1 绪论

1.1 血管发育概述

1.2 AGGF1的研究进展

1.3 斑马鱼作为模式动物简介

1.4 Morpholinos knockdown原理

1.5 本研究的目的和意义

2 实验材料与方法

2.1 实验仪器

2.2 试剂盒，主要试剂

2.3 实验材料

2.4 实验方法

3 实验结果

3.1 斑马鱼AGGF1基因全长cDNA克隆与序列分析

3.2 斑马鱼AGGF1蛋白的序列比对及结构域分析

3.3 AGGF1基因在斑马鱼胚胎中表达谱分析

3.4 AGGF1 Knockdown后的表型分析

3.5 AGGF1 Knockdown后影响血管发育

3.6 AGGF1促进血管生成

3.7 AGGF1决定静脉血管分化

3.8 AGGF1通过AKT信号通路调控血管发育

总结与展望

致谢

参考文献

附录1 攻读博士学位期间发表学术论文目录

附录2 本文所用到的主要缩略语