Daintain/AIF-1(Y54A)突变体的构建表达及其在细胞Raw264.7中的功能

摘要

1994年Chen等从猪的小肠中分离纯化出一种新的生物活性蛋白,Daintain(大炎肽),其氨基酸序列与1995年由美国Utans研究小组在同种异体大鼠心脏移植排斥反应中克隆出的巨噬细胞因子AllograftInflammatoryFactor-1(同种异体移植炎症因子-1,AIF-1)的同源性高达90％,故并称为Daintain/AIF-1。该蛋白由激活的巨噬细胞表达和分泌,是一种多功能的免疫细胞因子,在血管病变、器官移植排斥、肿瘤以及自身免疫疾病中起作用。
　　Daintain/AIF-1分子量17KD,由146个氨基酸组成,含有两个EF手型结构域,属于EF家族中的EH结构域蛋白亚家族。其中一个EF手型结构域具有Ca2+结合能力,当这个EF手型结构域中59位天冬氨酸突变为丙氨酸后,Daintain/AIF-1(D59A)的钙离子结合能力丧失,并且其促进血管平滑肌细胞(VascularSmoothMuscleCell,VSMC)迁移的能力下降。除此之外,Daintain/AIF-1还含有PDZ结构域结合基序和酪氨酸激酶磷酸化位点(37位,54位,103位,124位)以及一个由44个氨基酸组成的-KR-KK-GKR-多肽激素前体模式。
　　酪氨酸磷酸化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,它在细胞信号转导等方面有重要的作用。酪氨酸磷酸化在细胞的所有磷酸化修饰中所占的比例非常低这种较低的酪氨酸磷酸化水平才能够保证细胞在内外信号的刺激下,作出灵敏准确的反应。
　　通过研究发现,17-β-雌二醇(E2)刺激的稳转pcDNA-Daintain的Raw264.7细胞系,经过免疫沉降实验后,检测到Daintain/AIF-1的表达结果呈阳性。同时,在使用PY20抗体检测免疫沉淀实验后的Daintain/AIF-1酪氨酸磷酸化情况中,检测结果同样呈阳性。但是在阴性对照也检测出与目标蛋白同样大小的蛋白。考虑到Daintain/AIF-1抗体非特异性结合的可能性。在这种因素无法避免的情况下,我们采用定点突变的方法进一步确定Daintain/AIF-1的酪氨酸磷酸化及其磷酸化位点。
　　通过生物信息学预测发现,Daintain/AIF-1中的54位酪氨酸残基在Daintain/AIF-1的功能调节中具有重要作用。
　　本研究的主要目的是探讨Daintain/AIF-1中的54位酪氨酸突变对于巨噬细胞Raw264.7的生理功能的影响,从而确定Daintain/AIF-1中的54位酪氨酸是否有可能是酪氨酸激酶磷酸化位点。本实验完成的工作主要有以下几个方面:
　　1.采用免疫沉淀的方法特异性富集稳转pcDNA-Daintain的Raw264.7细胞系中Daintain/AIF-1蛋白。
　　2.使用PY20抗体检测Daintain/AIF-1内酪氨酸发生磷酸化。
　　3.运用生物信息学的方法确定Daintain/AIF-1中的54位酪氨酸残基在Daintain/AIF-1的功能调节中有重要作用。
　　4.使用重叠延伸PCR的方法克隆出Daintain/AIF-1(Y54A)基因,构建pET23a(+)-Daintain/AIF-1(Y54A)载体。
　　5.表达纯化Daintain/AIF-1(Y54A)蛋白。
　　6.比较天然Daintain/AIF-1和突变体Daintain/AIF-1(Y54A),发现Daintain/AIF-1(Y54A)促进Raw264.7细胞的增殖及NO的释放。
　　比较发现,天然Daintain/AIF-1和突变体Daintain/AIF-1(Y54A)对Raw264.7细胞的增殖及NO释放的影响无明显差异。故Y54位酪氨酸没有发生磷酸化。

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1 绪论

1.1 蛋白质磷酸化的研究状况及意义

1.3 Daintain/AIF-1生理功能研究进展

1.4 本研究的目的和意义

2 蛋白质的理化性质及磷酸化分析

2.1 常用的蛋白磷酸化预测软件简介

2.2 预测结果分析

3 实验材料与仪器

3.1 实验菌株、载体质粒及细胞系

3.2 菌种培养所用培养基

3.3 生化试剂

3.4 主要仪器设备

3.5 实验室常用溶液的配制

4 实验方法

4.1 稳定转染pcDNA-Daintain的Raw264.7细胞系的建立

4.2 免疫沉淀和Daintain/AIF-1酪氨酸磷酸化检测

4.4 Daintain/AIF-1(Y54A)基因的初步表达与鉴定

4.5 克隆的Daintain/AIF-1(Y54A)的分离纯化

4.6 分离纯化蛋白的蛋白免疫印迹（Western blot）分析

4.7 MTT法检测Daintain/AIF-1(Y54A)对Raw264.7细胞活力的影响

4.8 一氧化氮含量检测

5 实验结果

5.1 免疫沉淀及Daintain/AIF-1酪氨酸磷酸化分析

5.2 Daintain/AIF-1(Y54A)突变体基因的克隆

5.3 Daintain/AIF-1(Y54A)基因表达的鉴定

5.4 蛋白免疫印迹（Western blot）分析

5.5 MTT鉴定细胞活性

5.6 细胞培养基中NO浓度的测定

6 讨论

6.1 Daintain/AIF-1中酪氨酸磷酸化分析

6.2 Daintain/AIF-1(Y54A)基因的克隆

6.3 表达载体及宿主菌的选择

6.4 融合蛋白表达的稳定性分析

6.5 突变蛋白Daintain/AIF-1(Y54A)的功能分析

致谢

参考文献

附录 主要缩略词表