T细胞亚群在淋巴细胞性胸腔积液中的免疫学特征

摘要

正常脏层和壁层胸膜构成的闭合腔隙内有一层稀薄的浆膜腔液,称为胸膜腔液,在呼吸运动中起着润滑的作用,其生成与吸收处于相对恒定的动态平衡当中。当胸膜受到恶性肿瘤侵犯或病原体感染等病理状态下,存在胸膜和血管通透性增加、壁层胸膜淋巴管堵塞等因素,从而导致胸膜腔液生成过快和(或)吸收减缓,过多的富含蛋白质和细胞成分的渗出液积聚于胸膜腔,便形成了胸腔积液。胸腔积液是临床上常见的疾病或并发症,但由于长期较少受到学界的重视,至今为止,从其免疫发病学机制到临床诊疗处理等方面仍存在诸多问题有待阐明。胸腔积液疾病中,以淋巴细胞性胸腔积液占的比重较大,其是指胸腔积液中淋巴细胞的数量占白细胞总数的50％以上,恶性肿瘤和结核性胸膜炎是其主要的病因,约占90%以上。恶性胸腔积液是多种恶性肿瘤尤其是肺癌晚期发生胸膜转移的结果,因缺乏有效治疗手段因而预后甚差,其中位生存期仅4—6月;结核性胸腔积液是结核病的其中一种类型,虽然是可治疗的疾病,然而随着免疫相关性疾病患病率增加、多重耐药性结核杆菌感染增多等因素的出现,目前仍然属于医疗、社会、经济负担较重的多发病。
　　淋巴细胞性胸腔积液中的细胞成分以T淋巴细胞占优势,其中又以CD4+的辅助性T(HelperTcell,Th)细胞为主。Th细胞是贯通固有免疫和获得性免疫的桥梁,在机体免疫反应的启动和维持中扮演核心角色。自从二十多年前发现Th1和Th2细胞以来,至今已有多个新的Th亚群被陆续地发现,包括调节性T细胞(Treg)、IL-17分泌性Th细胞(Th17)、Th9、Th22等。它们是受到不同的疾病免疫微环境刺激后,从初始(Na?ve)CD4+T细胞分化而来,并具有各自的独特生物学功能特征,介导着截然各异的免疫学效应。目前国内外关于这些新型Th亚群在淋巴细胞性胸腔积液中的的表型和免疫学活性研究甚少。
　　因此,本系列研究瞄准国际前沿领域,对这些T细胞亚群的生物学特征、所介导的免疫反应、以及如何参与胸膜疾病发生发展的机制展开了研究。除了加深人们对这些重要的T细胞亚群免疫学特性的认识、从崭新的角度出发来阐明胸膜疾病的发病学机制之外,还为临床更好地控制肿瘤性和感染性疾病提供了新的干预途径和理论依据。本论文的系列研究围绕着T细胞亚群在淋巴性胸腔积液中的免疫学特征,总共展开了6部分研究:
　　第一部分白细胞介素-17分泌性CD4+T淋巴细胞在恶性胸腔积液中的发生和分化机制
　　目前已知,分泌白介素(IL)-17的辅助性T淋巴(Th17)细胞在人类的某些恶性肿瘤环境中显著增多。但人们对于恶性胸腔积液(MPE)中的Th17细胞调节抗肿瘤免疫的机制仍知之甚少。在本部分研究中,我们采用流式细胞技术和免疫荧光双染法,探讨了Th17在肺癌转移所致胸腔积液患者的MPE及外周血中的分布、表型特点,同时探讨了细胞因子对Th17细胞发生和分化的影响,以及趋化因子CCL20和CCL22对Th17的体外趋化活性的影响。研究结果显示,与外周血相比,MPE中的Th17细胞的数量显著增多。体外研究发现IL-1β、IL-6、IL-23、以及它们的各种组合均能够促进初始CD4+T细胞向Th17细胞定向分化。在体外趋化实验中可观察到,MPE对Th17细胞具有趋化活性,此种趋化性可被抗CCL20或/和抗CCL22单克隆抗体部分阻断。研究数据还显示,MPE中Th17细胞的聚集预示患者预后有所改善。因此,MPE中Th17细胞增多的原因可能在于胸膜腔内的促炎性细胞因子对Th17细胞定向分化和扩增起到刺激作用,胸膜腔内的趋化因子CCL20和CCL22对可以募集外周血Th17细胞浸润到胸膜腔。本部分研究提示,在肿瘤疾病中针对对Th17细胞亚群进行调控和增强免疫的策略,可有助于延长晚期癌症患者的生存时间。
　　第二部分恶性胸腔积液中的CD39+调节性T细胞通过LAP依赖性途径抑制Th17细胞发生和分化过程
　　现有研究发现,调节性T细胞(Tregs)和IL-17分泌性辅助性T(Th17)细胞均参与了人类恶性肿瘤疾病的发生,然而对于恶性胸腔积液(MPE)中Tregs对Th17细胞发生分化的调节却研究甚少。在本部分研究中,我们采用了流式细胞仪检测肺癌患者MPE和外周血中CD39+Tregs和Th17细胞数量,同时研究Tregs对Th17细胞发生分化过程的调节作用。研究结果显示,与外周血相比,MPE中CD39+Tregs和Th17细胞数量均显著增多,并且这两个细胞亚群数量之间呈负相关。MPE中IL-1β,IL-6和TGF-β浓度亦高于相应的同源外周血清,MPE中CD39+Tregs表面能够表达潜在型结合肽(Latencyassociatedpeptide,LAP)。CD39+Tregs可抑制初始CD4+T细胞向Th17细胞定向分化,这种抑制效应随这CD39+Tregs数量增多而增强,当加入LAP阻断抗体后CD39+Tregs介导的抑制效应被逆转。本部分研究提示,CD39+Tregs可以通过LAP依赖性途径抑制Th17细胞的发生和分化过程。
　　第三部分结核性胸膜炎中的胸膜间皮细胞促进IL-22分泌性CD4+T细胞的分化和募集
　　根据研究报道,IL-22分泌性辅助性T(Th22)细胞参与了结核杆菌感染的免疫反应。然而关于结核性胸腔积液(TPE)中Th22细胞的分化与免疫调节机制尚未明确,本部分研究旨在阐明Th22细胞分化及其向胸腔浸润的机制,以及与胸膜间皮细胞之间的相互免疫调节机制。我们检测了TPE和外周血中Th22细胞的分布及表型,探讨了促炎性细胞因子以及胸膜间皮细胞(PMCs)的抗原提呈作用对Th22细胞定向分化过程的影响,同时研究了PMCs分泌的趋化因子对Th22细胞的趋化活性。本部分研究结果显示,TPE中Th22细胞数量较外周血中明显地增高。IL-1β,IL-6,和/或TNF-α能够促进CD4+T定向分化为Th22细胞。PMCs可表达CCL20,CCL22,和CCL27,TPE以及PMC培养上清能够募集外周血中的Th22细胞浸润到胸膜腔,此趋化效应可被抗–CCL20,–CCL22,和–CCL27中和抗体部分阻断。IL-22和IL-17可以显著地促进PMCs的损伤修复。另外,PMCs能够通过提呈结核特异性抗原,促进CD4+T细胞增殖及Th22细胞的发生分化。因此,本部分研究提示,胸膜腔中的细胞因子以及PMCs分泌的趋化因子可能是引起TPE中Th22细胞数量增多的原因,TPE中PMCs与Th22细胞间存在协同关系。PMCs是一种新型的抗原提呈细胞,能够刺激CD4+T细胞增殖并且分化为Th22细胞。
　　第四部分恶性胸腔积液中的IL-22分泌性CD4+T细胞的免疫调节作用
　　根据研究报道,Th22细胞与人类癌症的发病过程有关,然而恶性胸腔积液(MPE)中Th22细胞的分化和免疫调节尚不为人知。本部分研究发现,MPE中Th22细胞增多,并且其分泌的IL-22能够显著促进A549细胞的增殖、抑制其凋亡、促进其向胸膜组织方向迁移,IL-22还增强A549细胞与胸膜间皮细胞层的相互粘附。本部分研究提示,Th22细胞在胸腔细胞因子和趋化因子的共同作用下募集浸润胸膜腔,其在人类恶性胸腔积液环境中对肿瘤细胞发挥了重要的免疫调节作用。
　　第五部分结核性胸膜炎中的胸膜间皮细胞促进Th9细胞分化和募集
　　最新发现的IL-9分泌性CD4+T(Th9)细胞参与了组织炎症反应和免疫应答,但Th9细胞在结核病中的分化和免疫调节机制尚不明确。本部分研究结果显示,相对于外周血而言,结核性胸腔积液(TPE)中Th9细胞数量明显增高,具有效应性细胞的表型特征。体外实验证实TGF-β在初始CD4+T细胞分化为Th9细胞的过程中发挥重要作用,并而联合IL-1β,IL-4或IL-6可以进一步促进Th9细胞的分化。TPE和PMCs培养上清对Th9细胞具有趋化活性,而抗–CCL20中和抗体可以部分阻断此趋化效应。IL-9具有促进胸膜间皮细胞损伤修复,抑制IFN-γ诱导的胸膜间皮细胞凋亡的作用。此外,胸膜间皮细胞能够通过递呈抗原促进Th9细胞定向分化。本部分研究揭示了Th9细胞新的功能特征,尤其是结核感染人体时Th9细胞与胸膜间皮细胞之间的免疫调节协同作用。值得一提的是,胸膜间皮细胞可作为抗原提呈细胞,促进Th9细胞分化。
　　第六部分恶性胸腔积液中IL-9分泌性CD4+T细胞的分化和免疫调节作用
　　据报道称,IL-9分泌性CD4+T(Th9)细胞与炎症反应和免疫疾病密切相关,然而Th9细胞与恶性疾病的关系尚未见研究报道。本部分研究旨在阐明恶性胸腔积液(MPE)中Th9细胞的分化机制,揭示其对肺癌细胞的免疫调节作用机制。我们检测了MPE和外周血中Th9细胞的比例,及其与Th1、Th17细胞之间的相关关系。探索了促炎细胞因子以及调节性T细胞(Tregs)在体外对Th9细胞分化过程的影响及机制。同时探讨了IL-9、IL-17和IFN-γ对肺癌细胞的作用以及其过程中的相关信号转导通路。本部分研究结果显示,MPE中Th9、Th17和Th1细胞比例均较外周血明显增高,而MPE中Th9细胞数量增多的原因可能在于局部促炎细胞因子和调节性T细胞的促进作用。IL-9和IL-17通过激活STAT3通路,显著地促进肺癌细胞的增殖和迁移,而IFN-γ则通过激活STAT1抑制肺癌细胞增殖和迁移,并诱导肺癌细胞凋亡。此外,IL-9和IFN-γ显著地促进肺癌细胞与胸膜间皮细胞层之间的相互粘附,而IL-17则不具备这种作用。本部分研究提示,MPE中数量增多的Th9细胞在肿瘤微环境中对肺癌细胞发挥着重要的免疫调节作用。

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第一部分 白细胞介素-17分泌性CD4+T淋巴细胞在恶性胸腔积液中的发生和分化机制

1 引言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 结论

第二部分 恶性胸腔积液中的CD39+调节性T细胞通过LAP依赖性途径抑制Th17细胞发生和分化过程

1 引言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 结论

第三部分 结核性胸膜炎中的胸膜间皮细胞促进IL-22分泌性

1 引言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 结论

第四部分 恶性胸腔积液中的IL-22分泌性CD4+T细胞的免疫调节作用

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 结论

第五部分 结核性胸膜炎中的胸膜间皮细胞促进Th9细胞分化和募集

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 结论

第六部分 恶性胸腔积液中IL-9分泌性CD4+T细胞的分化和免疫调节作用

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献

综述

致谢

附录