超声靶向微泡破碎联合PEI介导PHD2-shRNA转染诱导血管生成因子表达的研究

摘要

缺血性心肌病(ischemic cardiomyopathy,ICM)是一种最常见的心血管疾病,已成为威胁人类生命健康主要疾病之一。目前,国内外常用的ICM治疗方法包括药物治疗、介入治疗及外科治疗,但少数病人由于心肌病变弥漫,导致上述方法治疗效果不佳。随着心血管疾病发病机制分子水平研究的深入,“治疗性血管生成(therapeutic angiogenesis)”基因疗法已成为ICM治疗的新方法。血管新生作为一个新的治疗途径可以增加缺血心肌的血流灌注,成了ICM治疗研究的热点。
　　经过多年研究,基因治疗在疾病治疗中展现出良好的应用前景。但疾病基因治疗的成功必需安全高效的基因载体和基因输送工具。病毒载体能够容易地促进外源性基因转染,转染率较佳,但存在安全隐患。非病毒载体安全、大容量和制备容易,有望较病毒载体具有更好的研究应用,但基因转染效率低。因此寻求一种安全有效的基因转染途径成为目前该领域研究的重点。随着超声造影剂作为一种新型基因载体可行性研究的逐步深入和超声介导微泡破坏增强基因转染机制认识的不断加深,超声靶向微泡破碎介导基因治疗应用日益广泛。但关键问题是超声辐照微泡介导基因转染某些细胞及体内组织或器官等效果不理想,难以满足临床治疗的需要。PEI是一种对无毒的商品化非病毒载体,可以提高基因对细胞转染效率。为此,本实验应用超声靶向微泡破碎联合PEI介导基因转染H9C2细胞诱导治疗性血管生成因子表达。
　　虽然大量研究证明超声辐照微泡介导基因转染的可行性及有效性,但超声辐照微泡介导基因转染细胞需要参数优化,以达到最大转染效率且使细胞死亡最小。另外超声辐照介导基因转染是否能够成功表达需要体外验证,为体内试验打下基础。本实验的研究目的是优化超声靶向微泡破碎联合PEI介导基因转染H9C2细胞的参数及在最佳参数下介导PHD2-shRNA转染常氧和缺氧H9C2细胞,验证PHD2-shRNA能够沉默PHD2,促进HIF-1α及下游血管生成因子表达的可行性,从而为超声靶向微泡破碎联合PEI介导PHD2-shRNA治疗大鼠心肌梗塞模型打下基础。本实验分为两部分。
　　第一部分：超声靶向微泡破碎联合PEI介导EGFP质粒转染H9C2心肌细胞参数优化
　　目的：探讨不同超声辐照参数对基因转染的作用,优化超声辐照参数提高基因转染效率,与此同时减少对细胞活性影响。
　　方法：体外培养H9C2心肌细胞,随机分为6组:(1)单纯质粒组(C);(2)超声(U)+微泡(M)组;(3)PEI(P)组;(4)P+M组;(5)P+U组;(6)P+U+M组。任意选取参数进行转染,转染12h、24h、48h及72h后荧光显微镜观察H9C2心肌细胞中绿色荧光蛋白质的表达。荧光蛋白表达最佳组设置不同参数,即改变超声强度、微泡浓度、辐照时间及质粒浓度等进行转染,辐照后以台盼蓝染色测定细胞存活率,流式细胞仪测EGFP质粒瞬时转染率,取得最佳的转染参数。
　　结果：上述各组在12h、24h、48h及72h荧光显微镜观察均可见荧光显示,但48h表达最强,其中P+U+M组相对其它组绿色荧光蛋白质的表达最多。P+U+M组设置不同参数进行转染后发现,超声辐照时间及质粒浓度一定时,随着超声强度及微泡浓度的增加,基因转染效率逐渐增加,具有统计学意义。但微泡浓度超过30％,超声辐照强度超过1.5W/cm2后基因转染效率不再升高,细胞死亡率明显增加(P<0.05)。固定超声强度(1.5W/cm2、微泡浓度(30%)和质粒浓度(8μg/ml),改变时间(15s、30s、45s、60s),结果显示超声辐照时间30s时转染效率最高(P<0.05),细胞死亡率相对较少。超声强度(1.5W/cm2)、微泡浓度(30%)及辐照时间(30s)不变时,随着质粒浓度的增加,基因转染效率增加,但质粒浓度增加到16μg/ml时转染效率不再增加,而增加质粒浓度对细胞存活率无影响。
　　结论：超声靶向微泡破碎联合PEI能显著增强EGFP质粒转染H9C2心肌细胞。根据不同参数转染后,30%的造影剂浓度、1.5W/cm2的声强、30s的辐照时间、16μg/ml细胞转染效率最高,是H9C2心肌细胞的最佳转染条件。
　　第二部分：超声靶向微泡破碎联合PEI介导PHD2-shRNA转染H9C2细胞诱导治疗性血管生成因子表达
　　目的：构建靶向PHD2基因的shRNA真核表达载体,应用超声靶向微泡破碎联合PEI介导PHD2-shRNA转染H9C2心肌细胞以探讨PHD2-shRNA对PHD2基因的沉默效应,及其促进HIF-1α及下游促血管生成因子(VEGF、TGF-β及bFGF)基因表达的可行性。
　　方法:构建靶向PHD2基因的shRNA真核表达质粒及对照质粒(单纯EGFP质粒)。体外常氧、缺氧培养H9C2心肌细胞,分为4组:(1)对照质粒常氧组;(2)PHD2-shRNA常氧组;(3)对照质粒缺氧组;(4)PHD2-shRNA缺氧组。超声靶向微泡破碎联合PEI介导PHD2-shRNA和对照质粒分别对上述各组进行转染。转染48h后荧光显微镜观察H9C2细胞中的荧光蛋白表达。Westernblot检测PHD2、HIF-1α蛋白表达水平,RT-PCR检测VEGF、TGF-β及bFGF的mRNA表达水平。
　　结果：测序分析证实PHD2-shRNA重组质粒构建成功;48小时后上述4组荧光显微镜下均可见荧光蛋白表达,强度无明显差异。Western-blot检测结果显示,PHD2-shRNA常氧和缺氧组PHD2蛋白条带亮度均明显低于相对应对照质粒常氧和缺氧组,而PHD2-shRNA常氧和缺氧组HIF-1α蛋白条带亮度明显高于相对应对照质粒常氧和缺氧组。对照质粒常氧组、PHD2-shRNA常氧组、对照质粒缺氧组和PHD2-shRNA缺氧组PHD2/GAPDH吸光度比值、HIF-1α/GAPDH吸光度比值两两之间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR分析显示PHD2-shRNA常氧和缺氧组VEGF、TGF-β和bFGFmRNA条带亮度明显高于相对应对照质粒常氧和缺氧组,各组之间不同指标两两比较差异具有统计学意义(P<0.05)。
　　结论：超声靶向微泡破碎介导PHD2-shRNA基因转染H9C2细胞后,可显著下调PHD2蛋白表达,促进HIF-1α及下游血管生成因子(VEGF、TGF-β及bFGF)基因表达,为缺血性心肌病体内基因治疗研究打下基础。

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第一部分超声靶向微泡破碎联合PEI介导EGFP质粒转染H9C2心肌细胞参数优化的研究

前言

材料与方法

1. 材料与仪器

2. 实验方法

3. 统计方法

结果

1. 荧光显微镜下观察EGFP在H9C2内的表达

2. 不同辐照参数对细胞转染效率和细胞活性的影响

讨论

结论

参考文献

附图

第二部分超声靶向微泡破碎联合PEI介导PHD2-shRNA转染H9C2细胞诱导治疗性血管生成因子表达

前言

材料与方法

1. 材料与仪器

2. 实验方法

3 检测方法

3.1 荧光显微镜观察荧光蛋白表达

3.2 RT-PCR检测VEGF、TGF-β和bFGF mRNA表达

3.3 Western-blot检测PHD2、HIF-1α蛋白的表达

4. 统计学分析

结果

1. 荧光显微镜观察荧光蛋白表达

2. Western-blot检测结果

3. RT-PCR结果

讨论

结论

参考文献

附图

综述

附录

致谢