重组腺相关病毒介导的MPRO基因干预对2型糖尿病的影响及其机制的研究

摘要

目的:研究重组腺相关病毒介导的MyostastinPropeptide(MPRO)基因重组体对高脂饮食诱导的C57/6J小鼠血糖血脂及胰岛素抵抗的影响及其作用机制。
　　方法:雄性,5周龄C57/6J小鼠,随机共分为四组,每组15只,分别为普通饮食的对照组(Control组),高脂饮食诱导的生理盐水(Saline组),rAAV-GFP组和rAAV-MPRO组,从第2周开始除普通饮食组外,其余组给予60％能量来自油脂的高脂饮食(D12492)。并每周监测C57/6J小鼠体重、血糖、血脂变化,根据空腹血糖>7.0mmol/L(126mg/dl)或随机血糖>11.1mmol/L(200mg/dl)纳入实验组。20周后将成模小鼠进行干预,rAAV-GFP组和rAAV-MPRO组分别从尾静脉注射rAAV-GFP和rAAV-MPRO病毒,Saline组给予相同剂量的生理盐水,继续监测体重、血糖、血脂变化,同时行腹腔葡萄糖耐量及胰岛素敏感试验,了解MPRO基因对C57/6小鼠胰岛素抵抗的影响。3周后行WesternBlot检测MPRO肌肉表达情况。行高胰岛素-正常血糖钳夹实验计算葡萄糖输注率,了解C57/6J小鼠胰岛素抵抗及葡萄糖转运情况。继续治疗24周后处死小鼠,分离腓肠肌、胫前肌、股四头肌、肱三头肌、腹膜后脂肪、附睾脂肪、皮下脂肪等分别称重,留取骨骼肌、心脏、肾脏、肝脏、主动脉、血样等标本,标本保存于-80℃冰箱备用,部分制成石蜡切片。酶联免疫试剂盒检测血清中血糖、胰岛素、甘油三酯、总胆固醇及低密度脂蛋白含量;苏木精-伊红染色(H-E染色)观察肌肉组织脂肪浸润情况,同时观察脂肪细胞的形态变化;免疫荧光了解葡萄糖转运因子在细胞膜及胞浆的分布情况;WesternBlot检测MPRO表达情况及胰岛素信号通路的磷酸化水平。同时提前给予MPRO基因干预,计算特殊饮食诱导的C57/6J小鼠2型糖尿病的发生率。
　　结果:rAAV-MPRO组相比正常对照组、rAAV-GFP组及生理盐水组能明显促进骨骼肌生长,且有统计学差异,其中以股四头肌增长更为明显(0.3475555±0.03114126g);rAAV-MPRO组棕色脂肪含量明显增加(0.9408889±0.1329365g),皮下脂肪(3.604222±0.1673333g)和腹膜后脂肪(1.633778±0.2539753g)明显减少且有统计学差异。同时腹腔葡萄糖耐量试验和胰岛素敏感试验显示:rAAV-MPRO组在负荷葡萄糖情况下,2h内血糖能迅速下降至接近基础血糖值水平(8.450±0.1118034mmol/L),较rAAV-GFP组(15.125±0.4272002mmol/L)和Saline组(14.925±0.2217356mmol/L)葡萄糖耐量明显改善。而在负荷胰岛素剂量作用下rAAV-MPRO组,2h内血清中血糖下降为基础血糖值百分比为(71.629270±2.116367%),但是生理盐水组和rAAV-GFP组血糖占基础血糖百分比分别为(90.551050±1.940292%)和(91.020320±2.806392%),可见MPRO基因干预后胰岛素抵抗和葡萄糖耐量明显改善,且血糖,胰岛素水平明显下降,但相对于正常对照组仍未能恢复正常。高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验也表明rAAV-MPRO组葡萄糖输注率(9.900000±0.3564225mg/kg/min)相对于生理盐水组(5.900000±0.1805342mg/kg/min)及rAAV-GFP组(6.191667±0.4740488mg/kg/min)葡萄糖输注率明显提高,对胰岛素敏感性明显提高。H-E染色时,显微镜下观察到rAAV-GFP组和生理盐水组肌肉组织中有大量脂质浸润,rAAV-MPRO组脂肪浸润明显减轻。WesternBlot结果表示:IR,IRS,GSK,AKT磷酸化水平明显增高,但总的含量无统计学差异。其作用机制为:rAAV-MPRO与体内抑制肌肉生长的Myostastin基因结合,而肌肉又是糖代谢的主要枢纽,通过胰岛素抵抗激活胰岛素通路的磷酸化水平,从而促进糖原合成,抑制糖原分解而降低血糖。理论上对于血脂应有一定的影响,但实际上血中FFA含量变化不大,可能还与脂质过氧化、无氧酵解、线粒体失能等多种途径相关联。此外我们还发现MPRO组促进葡萄糖转运因子4从细胞浆向细胞膜转移,增加葡萄糖转运。能降低C57小鼠2型糖尿病发病率,且有统计学意义。
　　结论:MPRO基因干预可以降低高脂饮食诱导的C57小鼠高血糖水平,提高葡萄糖耐量,改善胰岛素抵抗,降低糖尿病发病率。该课题初步证明通过抑制Myostastin基因,促使肌肉生长,降低血糖、血脂,改善胰岛素抵抗,将为2型糖尿病的基因治疗提供一个新思路及新的理论依据,从而可用于将来2型糖尿病的治疗及预防。

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研究背景

第一部分 （在体试验）重组腺相关病毒介导的MPRO基因干预对高脂饮食诱导的C57小鼠胰岛素抵抗及血糖脂质代谢的影响及其机制

实验器材

一、主要实验材料：

二、主要试剂

实验方法

一、rAAV-MPRO和rAAV-GFP的病毒包装

二、 实验动物模型制备及分组

三、血糖血脂等生化指标

四、 体重变化情况：动物干预前后每周检测一次体重，比较各组小鼠体重变化情

五、 腹腔葡萄糖耐量实验

六、 腹腔胰岛素耐量实验：

七、高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验：

八、C57/5J小鼠各部分肌肉和脂肪分布情况

九、H-E染色：

十、免疫荧光染色:

十一、western blot检测组织蛋白质的表达

十二、统计学分析

实验结果

一、 rAAV-MPRO成功感染

二、 干预前后C57小鼠体重变化情况

三、 干预前后C57小鼠血糖血脂变化情况

四、 腹腔葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量试验

五、 治疗20W后，行高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验

六、 C57/5J小鼠各部分肌肉和脂肪分布情况

七、 组织形态学观察：

八、 免疫荧光

九、 Western blot

第二部分提前给于重组腺相关病毒介导的 MPRO 基因干预对高脂饮食诱导的C57小鼠2型糖尿病的发病率的影响

实验方法

一、动物模型制备

二、 体重变化情况及血糖血脂、胰岛素等生化指标

三、IPTT实验

四、C57小鼠的糖尿病发病率计算

五、统计方法

实验结果

一、 干预后小鼠体重、血糖血脂变化情况

二、 IPTT实验

三、C57小鼠的糖尿病发病率

全文讨论

总结

参考文献

综述

参考文献

致谢