人巨细胞病毒对早孕绒毛外细胞滋养细胞免疫功能影响的体外研究

摘要

第一部分T细胞免疫对感染HCMV的绒毛外细胞滋养细胞保护作用研究
　　【目的】体外研究T细胞对感染HCMV的绒毛外细胞滋养细胞的免疫效应。
　　【方法】①选择人早孕胎盘绒毛滋养细胞株HPT-8进行研究,建立感染HCMV的HPT-8细胞模型:以100TCID50HCMV攻击HPT-8细胞后,应用免疫荧光细胞化学法检测HCMVpp65抗原表达及病毒滴定法观察HPT-8感染情况并绘制生长曲线,判定HPT-8细胞对HCMV的易感性,感染状态以及HCMV在细胞内生长情况。②收集门诊孕前咨询健康妇女外周血,提取外周血单个核细胞,尼龙毛柱法分离纯化获得T细胞。③建立T细胞与感染HCMV的HPT-8细胞共培养模型,应用实时荧光定量PCR法检测HPT-8细胞内HCMVDNA负荷量。
　　【结果】①加入HCMV48h后,HPT-8细胞胞质内出现大量HCMVpp65抗原信号;感染3d后的HPT-8细胞培养液(Trophoblastconditionedmedium,TCM)可使HEL细胞发生细胞病变;HCMV在HPT-8细胞内的复制于第4d开始增高,6d达到高峰。②T细胞具有下调HPT-8细胞内HCMVDNA负荷量的作用(p<0.05);T细胞与感染的HPT-8细胞共培养3d后的细胞上清,也具有下调HPT-8细胞内HCMVDNA负荷量的作用(p<0.05);共培养3天后的T细胞则失去了下调HPT-8细胞内HCMVDNA负荷量的作用(p>0.05)。
　　【结论】T细胞在母-胎界面HCMV感染初期具有一定的免疫防御作用,其机制可能与T细胞的直接溶解杀伤作用及其分泌的细胞因子相关;但T细胞的免疫功能很快受到抑制,其中的机制有待进一步研究。
　　第二部分HCMV感染后绒毛外细胞滋养细胞分泌产物对外周血T细胞Treg/Th17平衡的影响
　　【目的】体外研究HCMV感染后绒毛外细胞滋养细胞分泌产物对外周血T细胞Treg/Th17平衡的影响
　　【方法】①选择人早孕胎盘绒毛滋养细胞株HPT-8进行研究,建立感染HCMV的HPT-8细胞模型。②尼龙毛柱法分离纯化获得T细胞。③建立TCM与T细胞共培养体系:100TCID50HCMV攻击HPT-8细胞后,收集HCMV感染72h以及相应时间点对照组的TCM,过滤离心后紫外灯照射15min灭活HCMV;根据T细胞培养液组分的不同,分为感染组(HCMV感染72h的TCM)、TCM对照组(对照组的TCM)及空白对照组(不含TCM),置于CO2培养箱(5％CO2、37℃)中继续培养72h。④应用流式分析法检测HCMV感染后绒毛外细胞滋养细胞分泌产物对T细胞内CD4+CD25+CD127-/CD4+、CD4+IL17A+/CD4+比值的影响。⑤应用实时荧光定量PCR法检测HCMV感染后绒毛外细胞滋养细胞分泌产物对T细胞分化相关转录因子Foxp3、IL-6、IL-17A、TGF-β及RORγtmRNA表达的影响;⑥应用ELISA法检测各组T细胞培养上清中TGF-β、IL-17A的浓度。
　　【结果】①与空白对照组相比,TCM对照组Treg/Th17比值增高(p<0.01);与TCM对照组相比,感染组Treg/Th17比值降低(p<0.01)。②与空白对照组比较,TCM对照组T细胞内Foxp3,RORγt及TGF-βmRNA的表达均明显升高(p<0.01);与TCM对照组比较,感染组T细胞内Foxp3,RORγt及TGF-βmRNA表达均明显减少(p<0.01)。③与空白对照组相比,TCM对照组T细胞内IL-17A和IL-6mRNA的表达均明显降低(p<0.01)。与TCM对照组相比,感染组T细胞内IL-17A和IL-6mRNA的表达均明显增加(p<0.01)。④与空白对照组相比,TCM对照组上清中TGF-β1浓度增加(p<0.01);与TCM对照组比较,感染组上清中TGF-β1浓度减少(p<0.01)。⑤与空白对照组相比,TCM组上清中IL-17A浓度减少(p<0.01);和TCM对照组相比,感染组IL-17A的浓度增加(p<0.01)。
　　【结论】绒毛外细胞滋养细胞分泌物可促使外周血T细胞Treg/Th17型免疫平衡向Treg细胞偏倚,有利于妊娠的维持,而HCMV可能通过影响绒毛外细胞滋养细胞合成及分泌功能从而使外周血T细胞内Treg/Th17平衡向Th17细胞偏倚,导致不良妊娠结局。
　　第三部分HCMV感染对绒毛外细胞滋养细胞合成分泌VIP表达水平的影响
　　【目的】体外研究HCMV对绒毛外细胞滋养细胞合成分泌血管活性肠肽(vasoactiveintestinalpeptide,VIP)表达水平的影响
　　【方法】①选择人早孕胎盘绒毛滋养细胞株HPT-8进行研究,建立感染HCMV的HPT-8细胞模型。②收集HCMV感染72h以及相应时间点对照组的细胞及TCM,TCM过滤离心后紫外灯照射15min灭活HCMV。③应用实时荧光定量PCR法检测HCMV感染对HPT-8细胞VIPmRNA表达水平的影响。④应用免疫细胞组织化学及免疫印迹法检测HCMV感染对HPT-8细胞VIP蛋白质表达水平的影响。⑤应用ELISA法检测HCMV感染对HPT-8细胞分泌VIP浓度的影响。
　　【结果】①与空白对照组相比,感染组HPT-8细胞VIPmRNA表达水平明显降低(p<0.01)。②空白对照组及感染组HPT-8细胞的胞质和胞浆均有VIP蛋白表达,呈棕黄色颗粒;感染组HPT-8细胞VIP蛋白表达水平明显低于空白对照组(p<0.01)。③感染组HPT-8细胞分泌VIP浓度明显低于空白对照组(p<0.01)。
　　【结论】母-胎界面HCMV感染抑制了绒毛外细胞滋养细胞合成和分泌的VIP表达水平。
　　第四部分黄芩素对感染HCMV的绒毛外细胞滋养细胞VIP表达水平的影响
　　【目的】探讨黄芩素阻断HCMV感染绒毛外细胞滋养细胞的作用及对HCMV感染的绒毛外细胞滋养细胞VIP表达水平的影响。
　　【方法】①选择人早孕胎盘绒毛滋养细胞株HPT-8进行研究,建立感染HCMV的HPT-8细胞模型。②收集HCMV感染72h以及相应时间点对照组、黄芩素组的HPT-8细胞及TCM,TCM过滤及离心后用紫外灯照射15min灭活HCMV。③应用实时荧光定量PCR法检测黄芩素对感染HCMV的HPT-8细胞HCMVDNA负荷量的影响。④应用实时荧光定量PCR法检测黄芩素对感染HCMV的HPT-8细胞内VIPmRNA表达的影响。⑤应用免疫细胞组织化学及免疫印迹法检测黄芩素对感染HCMV的HPT-8细胞内VIP蛋白质表达水平的影响。⑥ELISA法检测黄芩素对感染HCMV的HPT-8细胞分泌VIP浓度的影响。
　　【结果】①黄芩素减少感染的HPT-8细胞内HCMVDNA负荷量。②与空白对照组相比,感染组HPT-8细胞内VIP蛋白转录,合成及分泌的表达均明显下降,差异均具有统计学意义(p<0.05);黄芩素组HPT-8细胞内VIP蛋白转录,合成及分泌的表达与正常对照组相比,差异均无统计学意义(p>0.05)
　　【结论】黄芩素对母-胎界面的HCMV感染及其导致的VIP表达异常具有一定积极影响。

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封面

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中文摘要

英文摘要

前言

第一部分 T细胞免疫对感染HCMV的绒毛外细胞滋养细胞保护作用研究

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

一、 HCMV AD 169株病毒毒力

二、 HPT-8细胞内HCMV检测结果

三、 T细胞分离纯化的鉴定

四、 HPT-8细胞内HCMV DNA 负荷量的变化

讨论

参考文献

第二部分 HCMV感染后HPT-8细胞分泌产物对外周血T细胞Treg/Th17平衡的影响

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

一、HCMV感染后TCM对外周血T细胞中Treg细胞表达的影响

二、HCMV感染后TCM对外周血T细胞内Th17 细胞表达的影响

三、HCMV感染后TCM对外周血T细胞中Treg/Th17细胞比值的影响

四、 HCMV 感染后 TCM 对外周血 T 细胞 Foxp3、TGF-β1、IL-6、RORγt 及IL-17AmRNA表达的影响

五、HCMV感染后TCM对外周血T细胞内TGF-β1及IL-17A浓度的影响

讨论

一、 Treg细胞的特征及其生物学效应

二、Th17细胞的特征及其生物学效应

三、妊娠过程中Treg/Th17细胞的平衡与失衡

四、EVT在母-胎界面免疫耐受中的作用

五、HCMV感染后HPT-8细胞分泌产物引起外周血T细胞内Treg/Th17平衡失调

参考文献

第三部分 HCMV感染对绒毛外细胞滋养细胞合成分泌VIP的影响

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

一、HCMV对HPT-8细胞VIP mRNA表达的影响

二、HCMV对HPT-8细胞VIP蛋白质表达的影响

三、HCMV对TCM中VIP蛋白质含量的影响

讨论

参考文献

第四部分 黄芩素对感染HCMV的绒毛滋养细胞VIP表达水平的影响

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

一、黄芩素的细胞毒性

二、黄芩素对HPT-8内HCMV DNA 负荷量的影响

三、黄芩素对感染HCMV的HPT-8细胞VIP mRNA表达的影响

四、黄芩素对感染HCMV的HPT-8细胞VIP 蛋白质表达水平的影响

五、黄芩素对感染HCMV的HPT-8细胞分泌VIP表达的影响

讨论

参考文献

小结

综述

参考文献

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