三种均一分子量当归多糖的制备、结构鉴定及体外抗肿瘤活性研究

摘要

大量研究结果表明,植物多糖具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗辐射等药理作用,故植物多糖的研究已成为当前科研领域的热点[1]。当归多糖作为我国传统中药当归中的主要活性成分之一,也引起了越来越多的关注。但目前,当归多糖的提取、分离、纯化工艺并不成熟,后期的结构分析及药理活性也未进行详细研究。本论文以道地药材岷县当归根饮片为原料,水提[2]得到水溶性当归粗多糖,再经一系列纯化、分离处理,得到均一分子量当归多糖组分ASP1;水提后当归药渣,用一定浓度的NaOH浸提、醇沉,得到碱溶性当归粗多糖,经纯化、分离处理后,得到两种均一分子量当归多糖组分ASP2、ASP3。通过化学分析、波谱分析及现代仪器分析技术的联合应用[3],对三种均一分子量当归多糖组分进行分子结构分析,并在此基础上,进一步研究各组分在体外对人肝癌HepG2细胞、人肺癌A549细胞,及人乳腺癌MCF-7细胞的抗肿瘤活性。为后续的体内抗肿瘤活性考察及抗肿瘤机制研究奠定扎实的实验基础。
　　第一部分三种均一分子量当归多糖的制备
　　以道地药材岷县当归根的饮片为原材料,经过水提、碱沉酸调、醇沉,得到水溶性当归粗多糖,粗多糖溶解后采用八次反复冻融法除蛋白,所得多糖溶液经截留分子量为3500Da的透析袋透析纯化,以除去引入的金属盐及大量小分子单糖、寡糖及色素等物质,最后通过葡聚糖凝胶G50色谱柱进行层析分离,得到均一分子量当归多糖ASP1;水提所剩当归药渣,经一定浓度的NaOH浸提、醋酸调节pH后浓缩、醇沉,得到碱溶性当归粗多糖,粗多糖适当溶解后再经H2O2脱色、除蛋白,超滤分级、分离得到另两种均一分子量当归多糖ASP2、ASP3。通过对三种均一分子量当归多糖的理化性质研究,判定其均不属于还原糖;通过对其糖含量、分子量的测定及紫外扫描来鉴定其纯度。其中苯酚-硫酸法测得各组分的糖含量分别约为95％、92%、88%,高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测得其重均分子量分别为122kDa、172kDa、80.9kDa,且色谱峰峰形尖且对称,紫外扫描图谱显示,各组分均不含有核酸和蛋白质。结果说明,各组分当归多糖分子量较为均一,且纯度较高,满足后续研究的要求。
　　第二部分三种均一分子量当归多糖的结构鉴定
　　首先采用化学方法对三种均一分子量当归多糖进行分析,其中包括:完全酸水解法确定三种均一分子量当归多糖的单糖组成;高碘酸氧化及Smith降解确定其所含糖残基类型及比例;甲基化分析验证其糖残基比例。波谱分析包括:红外光谱扫描表征三种均一分子量当归多糖的特征吸收峰和各糖残基构型;1D、2DNMR分析其糖残基类型、连接顺序及取代位点。采用原子力显微镜扫描法观测多糖分子的表观形貌。最终综合各分析结果,以鉴定多糖结构。完全酸水解实验结果表明,ASP1、ASP2与ASP3均由阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖及葡萄糖组成,其组成比例分别是:ASP1为1:4:10:30,ASP2为1:2.5:1:5,ASP3为1:2:2:3.5;综合化学分析结果表明,三种均一分子量当归多糖由末端或1,6-连接、1,4-连接及1,3-连接类型的糖残基组成,其比例分别是:ASP1约为2:3:5,ASP2为1.3:3.6:5.1,ASP3为3:3:4;FT-IR扫描结果表明各组分均具有多糖的特征吸收峰,且均具β-D-吡喃糖结构;NMR的信号数据分析结果,通过对其中碳氢原子进行归属及相关关系的推断,可进一步验证化学分析的结果;AFM考察结果从直观上验证了化学分析和波谱分析的结果,即各组分当归多糖的分子组成极为复杂,其分子主链不长且多分支,而支链较多且复杂,导致其空间结构在水溶液状态下,由于氢键缔合与范德华力等作用而彼此交联形成多糖聚集体。
　　第三部分三种均一分子量当归多糖的体外抗肿瘤活性研究
　　采用四甲偶氮唑盐(MTT)比色法考察三种均一分子量当归多糖ASP1、ASP2与ASP3分别对HepG2细胞、A549细胞及MCF-7细胞体外增殖的抑制作用[4]。实验结果表明,三种均一分子量当归多糖对三株肿瘤细胞的体外增殖均有显著的抑制作用,且随着药物浓度的增加,其抑制率增高,整体呈剂量依赖性,线性关系较好。三种均一分子量当归多糖对不同肿瘤细胞具有选择性抑制作用,对HepG2细胞的抑制率最高可达34%左右,对A549细胞的抑制率有33%左右,而对MCF-7细胞的抑制率为29%左右。同时对于同一株细胞,不同组分三种均一分子量当归多糖样品的抑制作用也有所不同,水溶性组分ASP1对于HepG2细胞的抑制作用明显高于碱溶性组分ASP2及ASP3,而对于A549细胞,ASP1的抑制作用则较ASP2及ASP3弱。同时,多糖组分的分子量也对其抗肿瘤活性有一定影响,对于HepG2细胞,分子量较小的组分ASP1及ASP3比分子量较大的组分ASP2具有更高的抑制率,对于A549细胞,两个碱溶性组分中,分子量较大的组分ASP2则具有较高的抑制率,而对于MCF-7细胞,三种组分的抑制作用则接近,没有显著差异。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分 三种均一分子量当归多糖的制备

1. 当归粗多糖的提取

1.1实验材料和仪器

1.2实验方法

1.3实验结果

2. 当归粗多糖的纯化分离

2.1实验试剂和仪器

2.2实验方法

2.3实验结果

3.三种均一分子量当归多糖的纯度鉴定

3.1实验材料和仪器

3.2实验方法

3.3实验结果

4.三种均一分子量当归多糖的定性鉴别

4.1实验材料和仪器

4.2实验方法

4.3实验结果

5讨论与结论

5.1当归多糖的提取

5.2当归多糖的纯化分离

5.3三种均一分子量当归多糖的纯度鉴定与定性鉴别

第二部分 三种均一分子量当归多糖的结构鉴定

1.三种均一分子量当归多糖的化学分析

1.1实验材料和仪器

1.2实验方法

1.3实验结果

2.三种均一分子量当归多糖的波谱分析

2.1实验材料和仪器

2.2实验方法

2.3实验结果

3.三种均一分子量当归多糖的分子表观形貌考察

3.1实验材料和仪器

3.2实验方法

3.3实验结果

4讨论与结论

4.1三种均一分子量当归多糖的化学分析

4.2三种均一分子量当归多糖的波谱分析

4.3三种均一分子量当归多糖的分子表观形貌考察

第三部分 三种均一分子量当归多糖的体外抗肿瘤活性研究

1.实验材料和仪器

1.1实验材料

1.2实验仪器

1.3实验试剂的配制

2.实验方法

2.2.1 细胞培养

2.2.2 实验分组

2.2.3 体外抑制实验

3.实验结果

3. 1 各组分多糖对HepG2细胞体外增殖的抑制作用

3.2 各组分多糖对A549细胞体外增殖的抑制作用

3.3 各组分多糖对MCF-7细胞体外增殖的抑制作用

4.讨论与结论

研究总结

参考文献

综述

附录

致谢