绿茶多酚对高脂诱导的代谢紊乱和血管内皮功能障碍的影响

摘要

第一部分：绿茶多酚对高脂诱导代谢紊乱的影响
　　目的:观察高脂膳食对大鼠代谢指标的影响和肝脏脂肪沉积以及肝脏糖脂代谢相关基因表达的影响,并观察绿茶多酚对高脂膳食诱导的代谢改变、肝脏脂肪沉积和糖脂代谢基因表达改变的干预效果。
　　方法:体重40-60g断乳雄性Wistar大鼠50只,适应性喂养一周后,分为5组,对照组给予标准饲料,高脂组和三个绿茶多酚干预组给予高脂饲料,实验开始时所有大鼠饮用去离子水,绿茶多酚干预组在达到成年体重后改为饮用不同浓度的绿茶多酚水溶液,第26周进行口服糖耐量试验(OGTT),26周末,处死大鼠,分离血清。用ELISA检测血清中胰岛素的含量;用生化试剂盒检测血糖、血脂水平,计算HOMA-IR指数;精确称量肝脏、睾周脂肪和肾周脂肪的重量,计算内脏脂肪系数和肝脏系数;取部分肝脏组织冰冻切片,进行油红O染色。采用实时荧光定量PCR方法检测肝脏组织中脂肪合成酶(FAS)、羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCoAR)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)、固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)、葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)的mRNA表达水平。
　　结果:对照组大鼠进食量显著高于其它组,但是各组大鼠能量摄入量没有显著差异。自第9周开始,高脂组大鼠体重显著高于对照组,这种差异持续到实验结束。实验结束时,高脂组大鼠体重和内脏脂肪系数都显著高于对照组,与高脂组相比,绿茶多酚干预组大鼠的体重和内脏脂肪系数都显著降低。与对照组相比,高脂组大鼠空腹血糖水平、空腹胰岛素水平,胰岛素抵抗指数和OGTT试验曲线下面积都显著升高,绿茶多酚干预降低了高脂饲养大鼠的血糖水平,胰岛素抵抗指数和OGTT试验曲线下面积,但是对胰岛素水平没有明显影响。高脂饲养导致了大鼠血脂紊乱,其中血清甘油三酯(TG),低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和总胆固醇(TC)水平与对照组相比显著升高,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平显著下降,LDL-C/HDL-C值显著上升,绿茶多酚干预降低了高脂饲养大鼠血清TG、TC、LDL-C、LDL-C/HDL-C的水平,但是对HDL-C的水平没有明显影响。高脂饲养引起了大鼠肝脏脂肪沉积,肝脏系数升高,并引起了肝脏中糖脂代谢相关基因的表达改变,其中脂肪合成相关的基因FAS、HMG-CoAR和SREBP-1和糖异生关键限速酶PEPCK和G6Pase的mRNA表达水平显著升高,脂肪酸氧化相关的基因PPARα和肝脏中主要的葡萄糖转运体GLUT2的mRNA表达水平显著降低。绿茶多酚干预降低了高脂饲养大鼠的肝脏系数和肝脏脂肪沉积,并抑制了高脂诱导的大鼠肝脏糖脂代谢基因表达改变。
　　结论:高脂饲养诱导大鼠发生代谢紊乱,肝脏脂肪沉积和糖脂代谢相关基因的表达异常,这些改变与能量摄入无关;绿茶多酚干预能够预防和改善高脂诱导的代谢紊乱和肝脏脂肪沉积。
　　第二部分：绿茶多酚对脂联素水平的影响及细胞信号机制
　　目的:绿茶多酚的代谢调节机制到目前为止尚不清楚。脂联素被认为是肥胖和胰岛素抵抗治疗的新靶点。本部分主要观察绿茶多酚对高脂饲养大鼠脂联素水平的影响并探索相关机制。
　　方法:动物饲养与干预同第一部分,血清脂联素水平采用ELISA方法检测,用实时荧光定量PCR检测大鼠内脏脂肪组织中脂联素和PPARγ的mRNA表达水平,采用免疫印迹法检测PPARγ,磷酸化PPARγ,细胞外信号调节激酶ERK1/2和磷酸化ERK1/2的蛋白表达水平。采用高糖DMEM培养基体外培养大鼠内脏脂肪组织,并进行绿茶多酚进行干预和ERK1/2的特异性抑制剂PD98059进行预处理。干预24h后,收集培养液,检测其中的脂联素水平,收集培养的内脏脂肪组织检测脂联素和PPARγ的mRNA表达水平以及PPARγ,磷酸化PPARγ,ERK1/2和磷酸化ERK1/2的蛋白表达水平。
　　结果:高脂组大鼠脂联素mRNA水平和血清脂联素水平都显著低于对照组,而绿茶多酚干预显著升高了脂联素水平。与对照组相比,高脂组大鼠内脏脂肪中ERK1/2的激活和PPARγ的磷酸化显著升高,而PPARγ的mRNA水平和蛋白表达水平显著降低,与高脂组相比,绿茶多酚干预组ERK1/2和PPARγ磷酸化水平显著降低,而PPARγ表达水平显著升高。采用高糖体外培养内脏脂肪组织也显著降低了内脏脂肪组织中脂联素mRNA水平,分泌到培养液中的脂联素水平和PPARγ的表达水平,而上调了ERK1/2和PPARγ的磷酸化水平。而绿茶多酚干预和ERK1/2抑制剂处理均能抑制高糖培养诱导的这些改变。
　　结论:上调脂联素水平是绿茶多酚抑制高脂饮食诱导代谢紊乱的重要机制之一。绿茶多酚通过抑制ERK1/2的激活,降低PPARγ的磷酸化水平和上调PPARγ表达水平来上调脂联素的水平。
　　第三部分：绿茶多酚对血管内皮高通透性的影响及机制
　　目的:观察高脂饲料饲养大鼠主动脉内皮通透性的改变和绿茶多酚的干预效果,并在体内、体外细胞实验中探索绿茶多酚调控通透性改变的机制。
　　方法:动物饲养与干预同第一部分,牛主动脉内皮细胞(BAECs)采用高糖培养基培养,分别采用绿茶多酚,二苯基碘(DPI)、SU5416(VEGF受体2抑制剂)、rhVEGF和β环糊精(胞膜窖结构抑制剂)进行干预后,检测单层BAECs通透性。大鼠主动脉内皮通透性采用伊文思蓝注射法测定,单层BAECs通透性利用穿过细胞的异硫氰酸荧光素(FITC)-右旋糖酐测定。采用二氢乙啶(DHE)荧光探针检测大鼠主动脉活性氧(ROS)水平,采用2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针检测细胞中的ROS水平。采用实时定量PCR方法检测VEGF和窖蛋白1的mRNA表达水平,采用ELISA检测大鼠血清和细胞培养液中的VEGF水平,采用蛋白免疫印迹法检测培养的BAECs中的cav-1蛋白表达水平。
　　结果:与对照组相比,高脂组大鼠主动脉通透性显著升高,与高脂组相比,绿茶多酚干预组主动脉通透性显著降低。高脂膳食显著上调了大鼠的血清VEGF水平、主动脉中VEGF的mRNA表达水平和主动脉中的ROS水平,而绿茶多酚干预显著抑制了高脂诱导VEGF和ROS水平的升高。采用高糖培养基体外培养BAECs,显著上调了单层BAECs的通透性、VEGF的表达和分泌水平、以及细胞内ROS水平,同时还上调了NADPH氧化酶亚基p22phox和p67phox亚基的表达水平,并诱导了窖蛋白1表达水平升高,而绿茶多酚显著改善了高糖诱导的BAECs通透性、VEGF的表达和分泌水平、ROS、NADPH氧化酶亚基和窖蛋白1表达水平的升高。与高糖培养类似,rhVEGF预处理显著升高了普通培养基培养的单层BAECs的的通透性,而VEGF受体抑制剂SU5416预处理、NADPH氧化酶抑制剂DPI预处理和检测前采用胞膜窖结构抑制剂β环糊精孵育都显著降低了高糖培养单层BAECs的通透性,SU5416预处理还显著降低了窖蛋白1的表达水平。
　　结论:高脂膳食能够诱导大鼠主动脉内皮通透性升高,这种效应能够被绿茶多酚有效改善。绿茶多酚调节高脂饲养大鼠内皮通透性的可能信号途径为:下调NADPH氧化酶表达水平,降低ROS产生,进而下调VEGF水平,降低窖蛋白1的表达水平,减少胞膜窖介导的大分子转运,改善内皮高通透性。

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前言

第一部分 绿茶多酚对高脂诱导代谢紊乱的影响

1前言

2材料和方法

3结果

4讨论

第二部分 绿茶多酚对脂联素水平的影响及细胞信号机制

1前言

2材料和方法

3结果

4讨论

第三部分 绿茶多酚对血管内皮高通透性的影响及机制

1前言

2材料和方法

3结果

4讨论

参考文献

综述

附录1：实时荧光定量PCR融解曲线

附录2：全文缩写词

附录3：研究生期间工作小结

致谢