Peyer小结B淋巴细胞分化过程中S1P1表达变化及Tfh相关因子对B淋巴细胞S1P1表达的影响

摘要

目的:
　　研究S1P1在不同分化阶段B淋巴细胞(B220+IgA-B淋巴细胞、B220+IgA+B淋巴细胞、B220-IgA+浆母细胞)的表达以及Tfh细胞因子IL-4、IL-21、TGF-β1等对S1P1表达的影响。
　　方法:
　　1.选用BALB/c小鼠,采用隔日口服0.1％牛血清白蛋白(BSA),两周后将小鼠断颈处死,取小肠段Peyer小结免疫组化染色,观察不同分化阶段的B淋巴细胞在Peyer小结中的定位及S1P1的分布情况。
　　2.流式细胞术检测Peyer小结细胞膜表面S1P1在(B220+IgA-B淋巴细胞、B220+IgA+B淋巴细胞、B220-IgA+浆母细胞)这三种细胞群中的表达情况。
　　3.选用BALB/c小鼠,无菌条件下采用密度梯度离心法获取脾脏单个核细胞。磁珠分选法获得纯度为95%以上的B220+细胞,分别加用IL-4、IL-21、TGF-β1孵育,于加入后0h、24h、48h、72h、96h收集细胞,流式细胞术检测IL-4、IL-21和对照组细胞膜表面S1P1的表达情况,判断这两个细胞因子对S1P1表达的影响。
　　4.对TGF-β1干预组及其对照组在24h、48h、72h提取细胞总蛋白,IL-4、IL-21干预组及其对照组在24h、96h、120h提取细胞总蛋白,Western-blot检测不同组别S1P1的表达。
　　结果:
　　1.免疫组化结果表明,Peyer小结生发中心存在大量B220+细胞,IgA+细胞散在分布于生发中心的明带与暗带,在明带偶可见其成团分布。CD138+细胞在生发中心暗带区可见散在分布。S1P1+细胞在生发中心明带与暗带均可见分布,以中央明带区数目更多。
　　2.流式细胞术检测Peyer小结细胞,测得细胞膜表面S1P1在B220+IgA-B细胞荧光率为(9.673±4.302)%,在B220+IgA+B细胞为(36.39±9.193)%,在B220-IgA+浆母细胞为(52.91±8.185)%。并且B220+IgA-B细胞与B220+IgA+B细胞相比,P<0.05;B220+IgA-B细胞与B220-IgA+浆母细胞相比,P<0.005;B220+IgA+B细胞与B220-IgA+浆母细胞相比,P>0.05。
　　3.细胞因子干预后的B220+细胞流式细胞术检测细胞膜表面S1P1发现,IL-4(200ng/107cells)干预0h,24h,48h,72h,96h后,S1P1表达细胞百分率为3.02±1.232,6.23±3.600,5.75±3.216,11.86±3.614,38.36±5.558;IL-21(100ng/107cells)干预0h,24h,48h,72h,96h后,S1P1表达细胞百分率分别为1.87±0.578,5.92±2.772,7.56±4.228,20.65±3.791,46.77±7.893;IL-4(200ng/107cells)与IL-21(100ng/107cells)共同干预0h,24h,48h,72h,96h后,S1P1表达细胞百分率分别为2.77±1.103,5.45±2.113,8.40±1.472,14.13±4.221,43.77±3.316;而未加细胞因子的对照组0h,24h,48h,72h,96h后分别为2.34±0.910,2.26±1.220,5.22±1.571,9.383±6.548,15.16±4.327。从结果中可以看出,各干预组与对照组在0到48h之间细胞膜表面S1P1表达量无明显差异,从72h到96h,各干预组S1P1表达量出现明显上升,说明IL-4与IL-21对B220+细胞上调细胞膜S1P1受体有促进作用。
　　4.Western-blot结果显示,TGF-β1刺激后的B220+细胞,其S1P1的表达量在24h、48h、72h呈上升趋势(时间点之间P<0.05),且高于对照组(24hP=0.0003,48hP=0.0006),说明TGF-β1对于B220+细胞上调S1P1表达有促进作用;IL-4、IL-21、IL-4和IL-21刺激组S1P1表达量在24h到96h之间呈明显上升趋势,且明显高于对照组,但96h到120h之间增长不明显。
　　结论:Peyer小结内B淋巴细胞经历B220+IgA-、B220+IgA+、B220-IgA+几个阶段,不断分化成熟,且逐渐从生发中心的暗带区迁移至FDC较多的明带区,在这里接触FDC提呈的抗原并受到CD4+T细胞进一步活化发育成浆细胞。而S1P1受体的表达量亦随其分化成熟不断上调,使其更易受S1P的趋化进入输出淋巴系统。Tfh细胞因子TGF-β1、IL-4、IL-21均能上调B淋巴细胞S1P1的表达,但是IL-4与IL-21干预组在96h之后,S1P1上升趋势不显著,提示可能S1P1表达量已达到最大值或饱和状态。

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英文摘要

第一部分Peyer小结B淋巴细胞不同分化阶段S1P1表达变化的实验研究

前言

材料和方法

一、材料：

二、方法

结果

1 . 行肠道刺激的小鼠与对照组小鼠Peyer小结HE染色结果对比

2 .小鼠P eye r小结免疫组化染色

3.Peyer小结细胞流式检测结果

讨论

小结

参考文献

第二部分脾脏B220+B细胞S1P 1的表达与IL-4、IL-21、TGF-β1的关系

前言

材料和方法

一、材料

二、实验方法

结果

1 磁珠分选B2 20+细胞结果

2. TGF-β1干预B220+淋巴细胞后S1P1表达量的变化

3. IL-4和IL-21干预B220+淋巴细胞后S1P1表达量的变化（图8）

讨论

小结

参考文献

综述

参考文献

致谢