生物芯片和纳米中药对肝胆肿瘤早期诊治的研究

摘要

第一部分生物芯片早期诊断肝胆肿瘤的探讨
　　PartⅠMeDIP芯片分析和建立胆管癌差异甲基化谱
　　目的:利用全基因组启动子区CpG岛甲基化位点检测芯片技术,分析人胆管癌细胞株与人正常胆管上皮细胞株间的基因甲基化差异,建立胆管癌基因差异甲基化谱,为寻找特异性胆管癌早期诊断标志物奠定。
　　方法:采用NimbleGenHG18CpGPromoter芯片(Roche,Germany)分别检测人胆管癌细胞株TFK-1和人正常胆管上皮细胞株BEC全基因组启动子区CpG岛甲基化位点,并分析比较两细胞株间的差异甲基化位点。并应用MolecularAnnotationSystem(MAS)软件分析差异甲基化位点对应的基因的功能。采用亚硫酸氢盐测序法(BSP)检测HOX基因甲基化水平。采用荧光定量PCR和western-blot法检测目的基因在细胞水平的表达情况。免疫组化检测目的基因在胆管癌和癌旁组织中的表达差异。甲基化PCR(MSP)检测甲基转移酶抑制剂干预前后,目的基因甲基化的变化情况。
　　结果:1.MeDIP芯片结果显示:相比于BEC细胞株TFK-1细胞株中有2103个CpG岛表现为差异性高甲基化;
　　2.在所有差异性高甲基化CpG岛中有97个基因属于HOX家族基因,这些基因涉及细胞分化、周期改变、粘附、侵袭与转移以及血管生成等多个肿瘤发生机制;
　　3.SignalMap软件分析这97个HOX家族基因,发现甲基化率最高的前15位基因是HOXA5、HOXA2、HOXA11、HOXB4和HOXD13。BSP证实其各自的甲基化率为:HOXA5(95.38％)、HOXA2(94.29%)、HOXA11(91.67%)、HOXB4(90.56%)和HOXD13(94.38%);
　　4.PCR和Western-blotting结果显示:在肝癌、胆管癌、胰腺癌和大肠癌等消化道肿瘤细胞株中,胆管癌细胞株TFK-1中HOXA5表达量最低。免疫组化显示:相比于癌旁和正常胆管组织而言,胆管癌中HOXA5表达量明显降低。MSP证实:在甲基转移酶抑制剂干预后,HOXA5在TFK-1中甲基化程度明显降低。
　　结论:1.MeDIP芯片是筛选胆管癌早期诊断标志物的有效方法之一;
　　2.DNA甲基化可能是HOXA5在胆管癌中表达降低的重要原因,且HOXA5高甲基化可作为胆道肿瘤的早期诊断标志物之一。
　　PartⅡ无透镜显微镜联合细胞诊断芯片集成系统的构建
　　目的:微流控芯片实验室(Lab-on-a-chip)技术越来越多地用于细胞毒性检测和药物测试。该技术主要利用蚀刻技术到以各种材料制作的芯片上的通道和孔洞构成的“网络”构建微型实验室。实际应用时,压力以精细控制的方式推动钠升的体积流过通道,从而实现在单个集成的系统上进行样品处理、混合、稀释、电泳、定点追踪以及色谱分析、染色和检测。本实验的目的是利用德国IBMT研究所先进的芯片实验室,构建一种方便携带使用、成本低廉、快速分析、样本和试剂消耗少的细胞诊断芯片。
　　方法:本实验利用接触式光学平板印刷技术的原理构建了一种无透镜荧光显微镜/光学显微镜联合细胞芯片集成系统。生物样本被放置在一个包含有一个1.5μl漏斗状的腔及底部为1μm厚的硅氮化合物的MEMS芯片内。再将芯片装载在一个5兆彩色CMOS成像元件阵列上,最后在两者间覆盖一个光滤片。利用此系统培养鼠源性纤维细胞L929和人胆管癌细胞TFK-1。同时,分别用ErythrosineB和FITC进行细胞染色处理后,再比较此系统与传统荧光显微镜的成像效果。
　　结果:1.该系统监测L929细胞及TFK-1细胞影像的对比度和清晰度与4x物镜下的影像基本一致;
　　2.定点追踪观察单个或少量细胞形态变化,效果良好;
　　3.L929经红染或绿色荧光染色后,该系统显示细胞形态清晰。
　　结论:该组件可用于动态定点监测细胞形态变化和细胞的荧光图像,为后期诊断芯片的进一步开发提供重要的参考数据。
　　第二部分雷公藤内酯醇新型固体纳米粒治疗肝胆肿瘤的实验研究
　　PartⅠ地西他滨和丙戊酸钠单用对人胆管癌生长抑制作用研究
　　目的:探讨地西他滨(DAC)和丙戊酸钠(VPA)单用对人胆管癌细胞株TFK-1、QBC939、HUCCT、CCLP1细胞增殖的影响,并探讨其可能的机制。
　　方法:1.采用CCK8法检测DAC、VPA单独使用时对细胞生长的抑制率;
　　2.应用流式细胞仪检测DAC、VPA单独使用后细胞周期的变化;
　　3.经Hochst33342/PI染色,光镜下观察经DAC、VPA单独使用后细胞形态的变化,同时应用流式细胞术检测处理后细胞凋亡情况;
　　4.光镜下观察经DAC、VPA单独使用细胞120h后,细胞分化的情况;
　　5.构建GFP-LC3质粒并转染细胞,再加入DAC、VPA单独使用处理72小时,荧光显微镜观察细胞自噬情况;
　　6.体内实验采用裸鼠TFK-1细胞皮下种植瘤模型,观察DAC、VPA单独使用对瘤体生长及生存率的影响。
　　结果:1.DAC、VPA单独使用对人胆管癌细胞的增殖抑制作用呈时间和剂量依赖性;
　　2.流式细胞术检测显示,随着药物浓度的增加和作用时间的延长,胆管癌细胞呈现明显的G2/M或G0/G1期阻滞;
　　3.经DAC、VPA单独使用后,光镜下可见凋亡的细胞呈明显的胞体固缩、核固缩、核碎裂及凋亡小体形成。流式细胞术结果表明:细胞凋亡呈剂量依赖性;
　　4.光镜下观察到DAC、VPA单独使用120h后,细胞形态呈树突状突起;
　　5.荧光显微镜下观察到DAC、VPA单独使用后,细胞有明显的自噬现象;
　　6.体内试验证明:当应用DAC或VPA后,总给药时间为2周时,其对裸鼠TFK-1细胞皮下移植瘤的生长有明显的抑制作用。而且,治疗组的裸鼠生存期较对照组明显延长。
　　结论:体外实验和体内实验均证实,DAC或VPA对胆管癌细胞均具有明显的生长抑制作用。
　　PartⅡ雷公藤内酯醇新型固体纳米粒对肝癌生长抑制的研究
　　目的:1.观察雷公藤内酯醇新型固体纳米粒(TP-SLN)经尾静脉注射给药对SPF级BALB/C小鼠的急性毒性研究;
　　2.观察TP-SLN对肝癌细胞株H22体外和荷瘤体内的抗肿瘤作用研究
　　方法:1.雷公藤内酯醇(TP)和TP-SLN分别作用于H22细胞24h、48h和72h后,CCK-8法检测细胞的存活率;
　　2.SPF级BALB/c小鼠50只(雌雄各半),按照0.65mg/kg,0.773mg/kg,0.919mg/kg,1.189mg/kg,1.300mg/kg单次尾静脉注射给予TP-SLN,共5个剂量组。观察小鼠单次给药的症状体征,统计死亡率、体重等相应指标的变化;
　　3.建立H22细胞BALB/c小鼠皮下移植瘤模型,分为生理盐水空白对照组,空白固体脂质纳米粒组,雷公藤内酯醇(TP)组,TP-SLN组,顺铂阳性对照组,隔日尾静脉给药后观察记录肿瘤的体积、体重、一般生长活动状况。12天后处死所有小鼠,剥离肿瘤组织进行称重。
　　结果:1.体外实验中,TP-SLN对H22细胞生长抑制呈时间和剂量依赖性,作用明显且强于TP;
　　2.TP-SLN对于SPF级BALB/c小鼠尾静脉注射途径而言,其LD50值为0.891mg/kg,95%的可置信区间是0.814mg/kg—0.971mg/kg。并且在该剂距范围内,TP-PM对于BALB/c小鼠而言,死亡率呈现良好剂量效应关系;观察发现:TP-PM对于SPF级BALB/c小鼠而言,在注射后的4hrs内小鼠均未出现死亡,随着时间的延长,部分小鼠症状逐渐加重抖动,共济失调,进而活动减少,活动抑制直至死亡;BALB/c小鼠死亡时间集中在24-48hrs,96hrs后绝大部分存活动物恢复正常的运动、呼吸等,体重上升。
　　3.与生理盐水空白对照组比较,TP、TP-SLN及顺铂均引起肿瘤体积下降和体重减轻。抑瘤率分别为22.4%、49.2%、51.5%。TP、TP-SLN与生理盐水空白对照组相比,小鼠的生活状态(体重、反应能力等)均有一定的改善。顺铂组生活状态无明显改善。
　　结论:与TP相比,TP-SLN体内、外对肝癌细胞的抑制增强且稳定、持久,副作用减弱。
　　PartⅢ地西他滨联合丙戊酸钠增强TP-SLN对人胆管癌细胞生长抑制作用的初步研究
　　目的:探讨DAC联合VPA能否增强TP-SLN对人胆管癌细胞杀伤作用。
　　方法:DAC联合VPA预处理TFK-1细胞3天后,再加入TP-SLN处理24h、48h和72h,采用CCK-8法检测细胞存活率。
　　结果:与未预处理组相比,地西他滨联合丙戊酸钠预处理后,TP-SLN对人胆管癌细胞增值抑制作用明显增强
　　结论:地西他滨联合丙戊酸钠预处理增强TP-SLN对人胆管癌细胞增值抑制效应。
　　第三部分应用无透镜显微镜联合细胞诊断芯片集成系统初探纳米中药对胆管癌细胞作用机制
　　目的:应用无透镜显微镜联合细胞诊断芯片集成系统观察纳米中药与胆管癌细胞间相互作用
　　方法:应用无透镜显微镜联合细胞诊断芯片集成系统培养TFK-1细胞72小时后,培养基中加入TP-SLN,采集处理24h、48h和72h后的细胞图像
　　结果:无透镜显微镜联合细胞诊断芯片集成系统动态观察到纳米药物与细胞的相互作用后,细胞形态发生变化,但纳米材料荧光信号很弱。
　　结论:无透镜显微镜联合细胞诊断芯片集成系统可应用于观察纳米药物与细胞相互作用过程。

目录

封面

声明

目录

主要略缩词一览表

前言

中文摘要

英文摘要

本研究创新点

第一部分 生物芯片早期诊断肝胆肿瘤的探讨

PartⅠMeDIP芯片分析和建立胆管癌差异甲基化谱

引言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

PartⅡ 无透镜显微镜联合细胞诊断芯片集成系统的构建

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 雷公藤内酯醇新型固体纳米粒治疗肝胆肿瘤的实验研究

PartⅠ 雷公藤内酯醇新型固体纳米粒对肝癌生长抑制的研究

1 材料与方法

2 方法

3 观察指标

4 结果

5.讨论

参考文献

PartⅡ 甲基化酶抑制剂作用于胆管癌的实验研究

材料与方法

结果

讨论

参考文献

PartⅢ 组蛋白脱乙酰化酶抑制剂作用于胆管癌的研究

材料与方法

结果

讨论

参考文献

PartⅣ 地西他滨联合丙戊酸钠增强TP-SLN对人胆管癌细胞杀伤

作用的初步研究

前言

材料与方法

结果

讨论

第三部分 应用无透镜显微镜联合细胞诊断芯片集成系统初探纳米中药对胆管癌细胞作用机制

前言

材料与方法

结果

讨论

综述

附录

致谢