小剂量内毒素对肠道上皮细胞天然屏障功能及TLR2,4表达的影响

摘要

目的:
　　以致病性大肠杆菌和双歧杆菌来源的内毒素作用于大鼠肠道正常上皮细胞IEC18后,观察不同细菌来源的内毒素对上皮细胞Toll样受体2和4表达的影响,以及跨膜细胞电阻的改变,探讨致病菌和双歧杆菌这两类不同肠道共生菌来源的小剂量内毒素诱导肠上皮细胞发挥免疫防御功能的机制。
　　方法:
　　将致病性大肠杆菌内毒素O127:B8加入细胞中,分别是0.5mg/ml,1mg/ml,5mg/ml3种不同浓度。幼儿双歧杆菌、长双歧杆菌、两双歧杆菌、青春双歧杆菌上清液分别稀释100倍,300倍加入细胞中。在干预4小时,8小时,12小时,16小时后采用荧光实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测上皮细胞干预后TLR2,4mRNA表达情况,找出最佳干预浓度及时间点后,实验分为六组:空白对照组、EPEC(O127:B8)组、幼儿双歧杆菌组、长双歧杆菌组、两双歧杆菌组、青春双歧杆菌组。Westernblot检测各实验组IEC18后细胞的TLR2,4蛋白的表达改变。上皮细胞跨膜电阻仪(EVOM)测量六组细胞在30分钟,60分钟,90分钟,120分钟的跨膜细胞电阻的改变。
　　结果:
　　根据qRT-PCR检查的不同干预条件下IEC18细胞的最佳时间为干预16小时,EPEC内毒素浓度为5mg/ml,四种双歧杆菌稀释300倍为有效浓度。在干预16小时后,EPEC组与对照组相比TLR2mRNA和TLR4mRNA的表达增加了7.46±1.227和13.77±1.27倍(P值均<0.001)。幼儿双歧杆菌组、长双歧杆菌组和青春双歧杆菌组的IEC18细胞与空白组相比TLR2mRNA的表达降低,有统计学意义(P值均<0.05)。幼儿双歧杆菌组0.39±0.12、长双歧杆菌组0.47±0.43和青春双歧杆菌组0.47±0.25,这三组双歧杆菌组间TLR2mRNA的表达差异无统计学意义(P>0.05)。两双歧杆菌组(0.55±0.27)TLR2mRNA的表达降低无统计学意义(P>0.05)。两双歧杆菌组(0.41±0.34)和青春双歧杆菌组(0.46±0.37)与空白对照组相比TLR4mRNA的表达降低(P值均<0.05)。而幼儿双歧杆菌(0.66±0.20)和长双歧杆菌(0.59±0.11)TLR4mRNA的表达降低无统计学意义(P值均>0.05)。这四种双歧杆菌组间TLR4mRNA的表达无统计学差异(P值均>0.05)。上述各实验组TLR2,4mRNA表达趋势的改变与westernblot检测各实验组干预后TLR2,4蛋白表达的改变一致。IEC18的跨膜细胞电阻值下降。幼儿双歧杆菌组、长双歧杆菌组、两双歧杆菌组、青春双歧杆菌组跨膜细胞电阻值分别下降了19％,18%,23%,23%。与空白组及四组双歧杆菌组间无统计学差异(P>0.05)。EPEC组跨膜细胞电阻下降了67%,有统计学差异(P<0.05)。
　　结论:
　　肠道上皮细胞是肠道粘膜免疫系统重要组成部分,正常肠道上皮细胞表达少量的TLR2和TLR4,防止有害病菌的入侵以及维持肠道众多共生菌稳定中起到重要作用。小剂量的致病性大肠杆菌内毒素作用于肠道上皮细胞,增加TLR2和TLR4的表达,使肠道在接触外来致病原时可以做出快速反应。双歧杆菌可降低TLR2和/或TLR4表达,推测肠道在致病菌刺激后,双歧杆菌通过降低肠道上皮细胞TLR2和/或TLR4的表达减少病原体与TLRs结合,或与致病菌竞争性结合TLRs,最终阻止TLRs介导的下游炎症反应。双歧杆菌使肠道上皮细胞的跨膜电阻影响不大,可以有效维持上皮细胞的通透性,避免病原体穿过肠道防御屏障。

目录

封面

声明

目录

英文缩略词列表

中文摘要

英文摘要

1前 言

2实验方法

2.1实验材料

2.2实验仪器

2.3实验方法及流程

3实验结果

3.1荧光实时定量PCR测定IEC18的TLR2，4mRNA表达

3.2 Wenster Blot测定IEC18的TLR2，4蛋白表达

3.3肠道上皮细胞跨膜电阻的改变

4讨论

5结论

参考文献

综述

参考文献

致谢

附录