RYR2基因G1885E,G1886S位点多态性与不明原因心脏性猝死的相关性探索

摘要

【研究背景】钙离子在维持心脏正常节律和兴奋-收缩耦联中发挥重要作用。RYR2基因编码心肌细胞肌浆网Ca2+释放通道-雷诺定受体2(Ryanodinereceptor2,RyR2),该基因的突变引起RyR2通道舒张期肌浆网Ca2+泄露增加,引发心肌细胞Ca2+稳态失衡,从而导致致死性心律失常。大量研究表明致心律失常性右心室心肌病(Arrhythmogenicrightventricularcardiomyopathy,ARVC)和儿茶酚胺性多形性室性心动过速(Catecholaminergicpolymorphicventriculartachycardia,CPVT)与RYR2基因变异存在相关性,而CPVT与ARVC患者平常可无明显临床症状和体征,约50％患者以晕厥和猝死为首发症状,易引起纠纷而需进行法医病理学尸体解剖检查,但多数案例心脏未检见明显形态学异常,此类案例常被称为不明原因心脏性猝死(Suddenunexplainedcaidiacdeath,SUD),是困扰法医病理学研究的难点之一。因此寻找一种分子病理学诊断方法,以确定上述患者的死因,对法医病理学领域SUD的诊断及临床上该类猝死的预防将具有重要意义。
　　【目的】通过对RyR2的功能状态具有重要调节作用的RYR2基因2个位点(G1885E、G1886S)的单核苷酸多态性(SNP)进行检测,分析2个位点多态性及其与SUD之间的关系,以期在分子遗传学水平对法医病理学SUD案例的死因诊断提供依据,为临床SUD的预防提供参考。
　　【方法】严格按照筛选标准选取湖北同济法医学鉴定中心2005-2011年间不明原因心脏性猝死案例(34例)为实验组,本中心亲子鉴定室无亲缘关系的健康人群(78例)为对照组;分别利用石蜡包埋组织基因组DNA提取试剂盒和全血基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA;选择RYR2基因2个位点(G1885E、G1886S)为目标观察位点,使用primerprimer5.0软件设计包含上述2个位点在内的特异性引物;PCR扩增目的基因片段(约269bp),纯化后测序;运用NCBI-BLAST软件与数据库中已登陆的序列对上述位点进行同源性分析并提取每个位点的基因型;运用软件SPSS17.0和Hard-WeinbergV2.0平衡检验进行数据统计分析。
　　【结果】(1)对照组78例样本中,73例测序成功,5例信号弱(weaksignals);实验组34例样本中,29例测序成功,5例信号弱。(2)实验组RYR2基因G1886S位点测序结果为:GG基因型89.66%(24/29),AG基因型13.79%(4/29),AA基因型3.45%(1/29),其中野生型G等位基因频率89.66%,突变型A等位基因频率10.34%。对照组RyR2基因G1886S位点测序结果为:GG基因型98.63%(72/73),AG基因型1.37%(1/73),AA基因型0%(0/73),其中野生型G等位基因频率99.32%,突变型A等位基因频率0.68%。两组之间基因型(GG、AG、AA)的分布具有统计学意义(P<0.05),等位基因频率(G、A)分布具有统计学意义(P<0.05),研究结果显示RyR2基因G1886S位点变异与SUD之间存在相关性。(3)实验组RyR2基因G1885E位点测序结果为:GG基因型100%(29/29),G等位基因频率100%。对照组RyR2基因G1885E位点测序结果为:GG基因型100%(73/73),野生型G等位基因频率100%。两组之间基因型及等位基因频率分布无差异及统计学意义。
　　【结论】(1)RYR2基因G1886S位点在我国汉族健康人群中的分布存在多态性,且该位点与SUD的发生具有明显的相关性,其中野生型G等位基因可能为SUD的保护基因,而突变型A等位基因可能是SUD的易感基因。(2)RYR2基因G1885E位点未发现多态性,与SUD的发生亦无相关性。

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主要缩略语英文对照

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1.材料

1.1样本与分组

1.2主要试剂及配制

1.3仪器

2.方法

2.1确定目标观察位点

2.2 设计PCR引物

2.3 提取基因组DNA

2.4 基因组总DNA浓度的测定

2.5 PCR扩增

2.6测序

3.统计学分析

3.1 Hard-Weinberg平衡检验

3.2 数据分析

实验结果

1.凝胶电泳结果

2.测序结果

2.1 RYR2基因G1885E位点测序结果

2.2 RYR2基因G1886S位点测序结果

2.3.RYR2基因G1885E、G1886S位点基因型统计结果

3.Hard-Weinberg平衡检验结果

3.1 对照组RYR2基因G1886S位点Hard-Weinberg平衡检验结果

3.2 实验组RYR2基因G1886S位点Hard-Weinberg平衡检验结果

讨论

1. RyR2通道结构及心肌细胞Ca2+循环

1.1 RyR2通道结构

1.2心肌细胞内Ca+循环

2.RyR2基因与SUD的关系

3.RyR2基因G1885E＆G1886S位点与SUD

4.研究优势和局限性

结论

参考文献

综述

附录1：硕士在读期间参与课题研究及发表论文情况

致谢