异常细胞周期G2/M期调控在鱼藤酮介导的多巴胺能神经元损伤中的作用研究

摘要

本文主要从以下几个方面展开论述:
　　第一部分 DNA聚合酶beta在ROT介导的细胞周期异常调控中的作用
　　第一节 帕金森病相关的损伤因素对SH-SY5Y细胞周期分布的影响
　　目的:观察各种PD相关的神经损伤因素对细胞周期分布的影响。
　　方法:体外培养多巴胺能细胞SH-SY5Y细胞，分别采用不同浓度的H2O2（100M、200M和500M）、MPP+（1mM、2 mM和4mM）和ROT（0.5M、2M和5M）处理细胞，四甲基偶氮唑盐法（MTT法）检测细胞活力；进一步PI单染活细胞流式细胞术检测细胞周期分布，FITC-BrdU和PI双参数流式细胞术分析DNA复制情况及细胞周期变化。
　　结果:各种神经损伤因素处理细胞后，细胞活力呈浓度依赖性降低，200M H2O2、2mM MPP+和2M ROT分别处理细胞36h后引起细胞活力降低为55.6％、50.7％和52.3％。进一步对三种药物的细胞周期检测发现，H2O2和MPP+引起的细胞处于G2/M期的比例升高不明显，而ROT在低浓度情况下0-0.25M之间时出现G2/M期抑制，而0.5M后随浓度升高G2/M期逐渐升高，至2M后G2/M期改变非常明显，并能维持G2/M状态。进一步光镜下观察H2O2、MPP+和ROT引起的细胞形态变化，H2O2、MPP+能引起突起明显减少、胞体变扁、不透明、胞质出现凝聚现象，而正常SH-SY5Y细胞经RA诱导后，形态上似神经元有较多突起，胞体透明；而ROT引起细胞形态明显破坏，呈现不规则形，并含有细胞碎片。应用0.25M和2M ROT处理不同时间后细胞周期分布明显不同，0.25M处理1.5d、3d、5d和7d，细胞周期主要阻滞在G1/S期，G2/M期变化不明显，而2M ROT能引起细胞周期G2/M期细胞明显增多，在36h达高峰，并维持一段时间，并且DNA含量大于>4N的细胞数明显增多，进一步应用FITC-BrdU检测BrdU掺入量分析DNA复制，发现在G2/M期后细胞没有发生细胞分裂却出现再次DNA复制增加（核内复制），甚至有8倍DNA含量的细胞形成。
　　结论:ROT（2M）能引起明显细胞周期G2/M期阻滞和核内复制，有助于探讨多巴胺神经元细胞周期异常调控以及核内复制过程。
　　第二节 DNA聚合酶beta在ROT介导的细胞周期异常调控中的作用
　　目的:探讨DNA聚合酶beta的表达在ROT介导的细胞周期异常调控中的作用。
　　方法:应用免疫印迹western blot法检测DNA聚合酶beta表达，应用抑制剂或siRNA抑制DNA聚合酶beta的表达，流式细胞术FITC-BrdU和PI双参数观察细胞周期及核内复制情况。进一步在ROT立体定向注射大鼠模型中观察DNA聚合酶beta的表达及与多巴胺神经元细胞周期的相关性。
　　结果:ROT能引起DNA聚合酶beta表达升高，而siRNA或抑制剂DDC能抑制ROT引起的DNA聚合酶beta表达，并抑制核内复制。而ROT立体定向注射SD大鼠体模型中发现受损的多巴胺能神经元细胞周期G1期标志cyclinD表达升高并胞浆中颗粒聚集，同时观察到神经元细胞周期中DNA聚合酶beta表达升高，且DNA聚合酶beta较特异的表达于中脑黑质致密部和网状部。
　　结论:DNA聚合酶beta可能是ROT介导的多巴胺能神经元细胞周期异常调控中的重要参与者。
　　第二部分 G2/M关键调控分子Cdc2在ROT介导的多巴胺能细胞损伤中的作用
　　第一节 Cdc2参与调节ROT介导的SH-SY5Y细胞周期G2/M期阻滞
　　目的:探讨Cdc2在ROT引起的细胞周期G2/M阻滞中的作用。
　　方法:应用流式细胞术PI单染活细胞检测ROT引起的细胞周期变化，免疫荧光Hoechst染色细胞核及吉姆萨（Giemsa）染色染色体变化，激光共聚焦显微镜检测Cdc2表达及其亚细胞定位，进一步免疫印迹western blot检测总Cdc2和p-Cdc2变化，以及免疫共沉淀检测总Cdc2中p-Cdc2表达；细胞周期抑制剂roscovitine和siRNA Cdc2抑制Cdc2的活性，及蛋白和RNA水平的表达，流式细胞术观察细胞周期的变化。
　　结果:经ROT不同浓度和不同时间处理细胞后，细胞活力呈浓度和时间依赖性降低，尤其是2MROT处理细胞36h后细胞活力减低到正常对照组的40-60％，并且胞浆和胞核中细胞凋亡分子 caspase-3活化增高，尤其是在细胞浆中表达明显增高。DNA经 Hoechst染色后，荧光显微镜下发现ROT引起细胞凋亡样改变，出现核皱缩和核碎裂，同时还可发现有细胞核双核或多核的存在。吉姆萨染色显示处于分裂期的细胞出现染色质的凝聚，而经ROT处理细胞却引起染色质较为分散并有核小体形成。经ROT（2M）分别处理12h、24h、36h和48h，处于G2/M期的细胞数比例呈时间依赖性增多，在36h时G2/M期细胞比例从24.0±1.6％升高到68.9±2.5％；同时激光共聚焦显微镜观察显示，经ROT处理36 h后，细胞中Cdc2在细胞浆中的表达明显增高甚至有Cdc2颗粒的聚集；进一步免疫印迹western blot法检测Cdc2总蛋白及p-Cdc2的表达发现，ROT（36 h）处理细胞后Cdc2蛋白表达升高，而Cdc2/cyclin B复合体中cyclin B表达却无明显表达增高；并能发现代表Cdc2活性的p-Cdc2（Thr161）表达降低或者代表Cdc2抑制性活性的p-Cdc2(Thr14或Tyr15）表达升高；应用Cdc2抗体沉淀细胞中的Cdc2抗原，western blot检测p-Cdc2(Thr14或Tyr15）的表达，发现ROT处理细胞36 h后，细胞中的Cdc2总蛋白中Cdc2活性是减低的，进一步证实ROT引起细胞中Cdc2的活性明显减低；细胞周期抑制剂roscovitine预处理细胞后，Cdc2活性减低，经ROT处理或无ROT情况下都能引起细胞处于G2/M期的细胞比例明显增高，使经ROT处理（12 h）后G2/M期的细胞比例从46.7±3.1％升高到65.9±1.7％；siRNA转染细胞在RNA水平降低Cdc2的表达，并抑制ROT引起的Cdc2表达增高和抑制ROT引起的细胞周期G2/M期阻滞，使处于G2/M期的细胞比例明显降低，从67.6±2.3％降低到45.6±3.1％。
　　结论:ROT引起的G2/M期明显阻滞可能和Cdc2活性降低相关，而ROT引起的Cdc2表达升高维持G2/M阻滞状态。
　　第二节 Cdc2聚集在多巴胺能神经元凋亡中的作用
　　目的:探讨Cdc2胞浆中聚集与多巴胺能神经元凋亡的相关性。
　　方法:进行细胞总蛋白的胞浆和胞核蛋白分离及western blot检测ROT引起的天冬酰胺内肽酶-3(caspase-3)的表达；免疫荧光Hochest染色检测细胞核形态变化，流式细胞术Annexin V/PI双标检测细胞凋亡；激光共聚焦显微镜观察Cdc2与caspae-3的亚细胞定位，并western blot检测siRNA介导的Cdc2减低引起的caspase-3/-9的表达变化；分别应用Cdc2抗体和GAPDH抗体进行免疫共沉淀，观察细胞内Cdc2与GAPDH在细胞内的相互作用。
　　结果:ROT能引起活化的caspase-3明显增高，尤其是胞浆中的活化的caspase-3表达；细胞形态显示核皱缩和核碎裂代表的细胞凋亡；流式细胞术检测结果显示ROT处理细胞36h后细胞凋亡率从6.6％升高到46.8％（P<0.05）；进一步应用siRNA降低Cdc2的表达，发现细胞凋亡明显降低，凋亡率从46.8％降低到31.0％(P<0.05)；并且镜下观察到Cdc2与活化的caspase-3在胞浆中存在共定位；且Cdc2表达减低抑制caspase-3/-9表达增高；在Cdc2引起的免疫沉淀组份中能检测到GAPDH表达，而GAPDH引起的免疫沉淀组份中也能检测到Cdc2的表达。
　　结论:Cdc2聚集可能通过影响caspase-3/-9通路参与细胞凋亡过程，而Cdc2聚集可能与GAPDH相关的降解途径异常相关。
　　第三部分 ROT介导的PD小鼠模型中细胞周期分子的表达及调控
　　目的:探讨ROT灌胃PD小鼠模型中异常的细胞周期调控。
　　方法:应用羧甲基纤维素（CMC）和氯仿充分溶解ROT，选22–26g雄性C57小鼠随机分三组：正常对照组（15只），溶剂对照组（15只），ROT组（20只），ROT组灌胃0.1ml/10g（30mg/kg，1次/dx30d），检测体重变化，提前3d进行行为学（爬杆实验和悬挂实验）检测，处死小鼠后行脑组织氧化应激和脂质氧情况检测；脑组织行多聚甲醛灌流后，冰冻切片免疫荧光检测细胞周期分子E2F1、alpha-synuclein和cleaved caspase-3等表达的检测；另设干扰组腹腔注射细胞周期抑制剂roscovitine，激光共聚焦显微镜下观察roscovitine对ROT介导的多巴胺神经元损伤的影响。
　　结果:持续灌胃30d后，小鼠体重有明显减退，自主活动减弱；行为学实验结果显示，小鼠爬杆及悬挂实验ROT灌胃小鼠较正常小鼠都有明显统计学差异；中脑组织氧化应激水平检测显示经ROT灌胃后小鼠的中脑黑质组织中脂质氧化丙二醛（MDA）水平较对照组明显升高（P<0.05）；而氧化应激活性分子超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽还原酶（GSH）活性降低（P<0.05）。进一步激光共聚焦显微镜下观察发现ROT引起中脑黑质多巴胺神经元的变性死亡，神经元数目明显减少，凋亡分子caspase-3活化增加，alpha-synuclein出现细胞中聚集，细胞周期调控分子E2F1免疫活性增强；而应用细胞周期抑制剂roscovitine预处理后能明显抑制多巴胺能神经元的损伤，并抑制凋亡蛋白caspase-3的活化。
　　结论:ROT灌胃小鼠模型能较成功模拟PD某些重要病理变化过程；ROT引起多巴胺神经元细胞周期异常，而细胞周期调控异常可能参与细胞凋亡过程。

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研究背景

参考文献

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第一部分 DNA聚合酶beta在ROT介导的细胞周期异常调控中的作用

第一节 帕金森病相关神经损伤因素对SH-SY5Y细胞周期分布的影响

参考文献

第二节 DNA 聚合酶beta在ROT介导的细胞周期异常调控中的作用

参考文献

第二部分 G2/M关键调控分子Cdc2在ROT介导的多巴胺能细胞损伤中的作用

第一节 Cdc2参与调节ROT介导的G2/M期阻滞

参考文献

第二节 Cdc2聚集在多巴胺能神经元凋亡中的作用

参考文献

第三部分 ROT介导的PD小鼠模型中细胞周期分子的表达及调控

参考文献

研究内容小结

综述

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