Nm23基因型-表型在湖北地区汉族健康人群和器官移植患者中的分布及相关性研究

摘要

目的：建立测定人红细胞（RBC）内NDPK活性的反相离子对HPLC法，并探讨RBC内NDPK的酶学动力学性质。通过测定湖北地区汉族健康人群和器官移植患者群体（包括肾移植及非肾移植患者）Nm23基因启动子区rs16949649C/T、rs2302254C/T及内含子区域rs7207370A/G、rs34214448G/T、rs11868380C/G、rs8075231C/T、rs2041296C/T、rs8071647G/T、rs2159359A/C、rs2318785A/G等10个单核苷酸多态性（SNPs）位点基因型、等位基因及RBC内NDPK酶活性，探索Nm23基因型及其表型在上述人群中的分布特征，并进行基因型-表型相关性研究。
　　方法：反相离子对HPLC法测定人RBC内NDPK活性：采用dADP和dGTP作为反应底物，在RBC裂解产物中NDPK的催化下，发生dADP+dGTPdATP+dGDP酶促反应。酶促反应条件为：pH7.0，孵育温度37℃，孵育时间5min。通过测定单位时间（min）、单位量血红蛋白（gHb）下生成反应产物dGDP的量来表示NDPK酶活性的高低。采用岛津LC-20A高效液相色谱仪，以肌苷为内标，检测反应产物中dGDP的浓度。色谱条件为：色谱柱SymmetryShield TM RP18（150mm×3.9mm,5mm），检测波长260nm，柱温25℃。
　　NDPK酶学动力学研究：利用NDPK催化dADP+dGTP/dATP+dGDP酶促反应，通过改变反应温度、热处理温度、pH条件来进行NDPK酶学性质的研究，通过底物动力学及产物抑制剂动力学研究酶学动力学反应机制及米氏方程参数。
　　中国湖北汉族健康人群及器官移植患者群体NDPK活性研究：采用第一部分建立的反相离子对HPLC法测定600例健康人及602例器官移植患者（包括300例肾移植患者及302非肾移植患者）RBC内NDPK的活性，阐明NDPK活性的分布特征，采用SPSS17.0软件统计性别、年龄对NDPK活性的影响。
　　Nm23基因多态性及与表型相关性研究：采用病例-对照研究，选择华中科技大学同济医学院附属协和医院和同济医院2012年3月至2012年6月门诊行免疫抑制药血药浓度监测的器官移植患者602例（300例肾移植患者及302非肾移植患者），及同时期华中科技大学同济医学院附属协和医院健康体检志愿者1000例，采用实时荧光TaqMan-MGB探针等位基因分型技术进行Nm23基因上10个位点基因型检测，并采用分片段扩增直接测序方法对上述位点进行抽样验证。采用SPSS17.0软件统计等位基因、基因型在各实验组中的分布特征、差异及Nm23基因多态性与NDPK活性关联性分析。运用Helpoview软件进行连锁不平衡分析。
　　结果：NDPK催化dADP+dGTP/dATP+dGDP酶促反应特异性良好，dGDP在1.04~50.00μmol/L-1范围内线性良好，定量下限为1.04μmol/L-1。日内、日间精密度（CV）均<7.00％，低、中、高浓度质控样品的提取回收率均值分别为100.61％、99.75％、113.47％（CV<6.00％）。准确度均值分别为106.32％、100.26％、100.40％，dGDP样品室温放置24h、4℃保存72h下稳定性良好，红细胞样本反复冻融3次、冰上放置6h及-80℃保存1y条件下NDPK活性稳定性良好。
　　NDPK在反应温度30~55℃范围内保持较高的活性且在45℃时达到活性最大值，pH6.0~9.0处酶活性较高且在pH6.0时活性最高。底物动力学研究中Linewever-Burk双倒数作图得出两组平行直线，通过二次作图计算得出Vmax分别为111.35和111.41μmol/min-1·(gHb)-1，Km dADP=1.26mmol·L-1，Km dGTP=1.94mmol·L-1。产物抑制动力学研究中当固定反应底物dGTP浓度、改变dADP浓度时，dATP表现为非竞争性抑制作用。当固定反应底物dADP浓度、改变dGTP浓度时，dATP表现为竞争性抑制作用。经米氏方程计算dATP抑制常数Ki分别为0.3385mmol·L-1和0.6750mmol·L-1。
　　NDPK活性在健康人群、器官移植患者（肾移植患者及非肾移植患者）中均呈偏态分布（P＜0.05）；600例健康人群NDPK活性分布范围为1.09~7.87μmol/min-1·(gHb)-1，中位数为2.99μmol/min-1·(gHb)-1；602例器官移植受者中，NDPK活性范围为1.13~7.71μmol/min-1·(gHb)-1，中位数为3.17μmol/min-1·(gHb)-1。其中肾移植患者亚组中，NDPK活性范围为1.14~7.71μmol/min-1·(gHb)-1，中位数为3.16μmol/min-1·(gHb)-1；非肾移植患者亚组中，NDPK活性范围为1.13~5.06μmol/min-1·(gHb)-1，中位数为3.19μmol/min-1·(gHb)-1。比较组内不同性别、年龄段时NDPK活性分布，其差异均无统计学意义（P＞0.05）。比较组间NDPK活性差异，发现器官移植组NDPK活性水平显著高于正常对照组（P＜0.001）；非肾移植组NDPK活性水平显著高于肾移植组和正常对照组（P＜0.05），但肾移植病例组同正常对照组NDPK活性分布差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　Nm23基因上所选10个位点均符合Hardy-Weinberg平衡，所有位点在湖北汉族健康人群中分布同国内其它地区研究及HapMap数据库中北京汉族人群、日本人群相近。Helpoview连锁不平衡分析结果表明，rs2302254C/T、rs2041296C/T、rs8075231C/T、rs8071647G/T、rs2159359A/C位点间，rs34214448G/T、rs7207370A/G、rs16949649C/T位点间高度连锁不平衡，rs11868380C/G、rs2318785A/G与其它位点之间相互独立，并筛选出4个Tag SNPs：rs34214448G/T、rs2302254C/T、rs11868380C/G、rs2318785A/G。分别将器官移植组或肾移植组作为病例组，健康人群为对照组；或肾移植组为病例组，非肾移植组作为对照组进行病例-对照统计分析，结果表明，各基因型、等位基因频率在所有病例组与对照组间分布均无统计学差异（P＞0.05）。运用基因的显性、隐形及加性效应模型分析，P值均＞0.05，相对危险度比值比0R值95％置信区间均包含1，说明各基因型及等位基因分布与对照组和病例组分组无关联。
　　Nm23基因多态性-NDPK活性相关性研究结果表明，rs16949649C/T、rs7207370A/G、rs34214448G/T、rs11868380C/G、rs2318785A/G等多态性位点不同基因型间NDPK活性分布差异具统计学意义（P<0.05）。其中，rs16949649C/T纯合子CC携带者NDPK活性水平显著高于纯合子TT及杂合子TC携带者（P<0.05），纯合子TT及杂合子TC携带者间NDPK活性分布差异无统计学意义（P＞0.05）。rs7207370A/G纯合子GG携带者NDPK活性水平显著高于纯合子AA及杂合子AG携带者（P<0.05），纯合子AA及杂合子AG携带者间NDPK活性分布差异无统计学意义（P＞0.05）。rs34214448G/T纯合子TT携带者NDPK活性水平显著高于纯合子GG及杂合子GT携带者（P<0.05），纯合子GG及杂合子GT携带者间NDPK活性分布差异无统计学意义（P＞0.05）。rs11868380C/G纯合子CC携带者NDPK活性水平显著低于纯合子GG携带者（P<0.05），纯合子GG与杂合子AG携带者、纯合子CC与杂合子AG携带者间NDPK活性分布差异无统计学意义（P＞0.05）。rs2318785A/G纯合子GG携带者NDPK活性水平显著高于纯合子AA及杂合子GA携带者（P<0.05），纯合子AA及杂合子GA携带者间NDPK活性分布差异无统计学意义（P＞0.05）。rs2302254C/T、rs2041296C/T、rs8071647G/T、rs8075231C/T、rs2159359A/C等多态性位点各基因型间NDPK活性分布差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　结论：本文中建立测定人RBC内NDPK活性的反相离子对HPLC方法操作简便，反应专属性强、灵敏度高、稳定性好，可应用于人体RBC内NDPK活性测定。
　　NDPK最适反应温度为37~45℃；最适pH为pH6.0~7.0；其酶促反应遵循乒乓机制；在文中实验条件下，NDPK酶促反应最大速度Vmax约为110μmol/min-1·(gHb)-1，Km dADP=1.26mmol·L-1，Km dGTP=1.94mmol·L-1。dATP抑制常数Ki约为0.34~0.67mmol·L-1。
　　NDPK活性在健康人群、器官移植患者（肾移植患者及非肾移植患者）中均呈偏态分布（P＜0.05）。年龄、性别对NDPK活性分布无明显影响（P＞0.05）。NDPK酶活性水平分布：器官移植组＞正常对照组（P＜0.001）；非肾移植组＞肾移植组及正常对照组（P＜0.05）；肾移植组同正常对照组差异无统计学意义（P＞0.05），推测免疫抑制药吗替麦考酚酯的应用或肾脏功能抑制等状态可能对机体NDPK活性具有显著性影响。
　　Nm23基因上rs16949649C/T、rs2302254C/T、rs7207370A/G、rs34214448G/T、rs11868380C/G、rs8075231C/T、rs2041296C/T、rs8071647G/T、rs2159359A/C、rs2318785A/G等10个SNPs位点基因型及等位基因在健康人群与器官移植患者、肾移植患者及非肾移植患者中分布无统计学差异（P＞0.05），通过显性、隐形及加性效应模型分析，发现上述位点多态性与慢性肾功能衰竭发病风险无相关性（P＞0.05）。基因型-表型研究发现，rs16949649C/T、rs7207370A/G、rs34214448G/T、rs11868380C/G、rs2318785A/G等位点多态性与NDPK活性水平具有显著相关性（P＜0.05）。其中，rs16949649CC、rs7207370GG、rs34214448TT、rs11868380CC、rs2318785GG等基因型NDPK活性水平显著性高于其他基因型（P＜0.05）。rs2302254C/T、rs2041296C/T、rs8071647G/T、rs8075231C/T、rs2159359A/C等多态性位点与NDPK活性水平无相关性（P＞0.05）。

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中英文缩略词对照

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英文摘要

前言

第一部分 反相离子对HPLC法测定人RBC内NDPK活性

1 实验材料

2实验方法与结果

3 讨论与小结

第二部分 NDPK酶学动力学研究

1 实验材料

2 实验方法

3 结果与讨论

4 小结

第三部分 中国湖北汉族健康人群及器官移植患者群体

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

第四部分 Nm23基因多态性及与表型相关性研究

1 实验材料

2 实验对象与方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

总结与展望

参考文献

综述

参考文献

附录1