湖北地区汉族健康人群和器官移植患者中RAC1基因型-表型的分布及相关性研究

摘要

[目的]通过测定湖北地区汉族健康人群和器官移植患者群体（包括肾移植及非肾移植患者）RAC1基因内含子区域rs836488 C/T、rs702482 T/A、rs10951982 G/A、rs702483 C/T、rs69549966 G/A以及3’UTR端rs9374 G/A等6个单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNPs）位点基因型、等位基因，RAC1基因转录的mRNA表达水平和蛋白活性，探索RAC1基因型及其转录的mRNA表达水平和蛋白活性在上述人群中的分布特征，并进行基因型-表型的相关性研究。
　　[方法] RAC1基因多态性研究：采用病例-对照研究，选择华中科技大学同济医学院附属协和医院和同济医院2012年8月至9月门诊行免疫抑制药血药浓度监测的器官移植患者602例（300例肾移植患者及302例非肾移植患者），及1000例同时期在华中科技大学同济医学院附属协和医院参加健康体检并合格的志愿者，采用实时荧光TaqMan-MGB探针等位基因分型技术进行RAC1基因上6个SNPs位点基因型检测，并采用分片段扩增直接测序方法对上述6个SNPs位点进行抽样验证。采用SPSS17.0软件统计等位基因、基因型在各试验组中的分布特征、差异。运用Helpoview软件进行连锁不平衡分析和标签单核苷酸多态性位点（Tag-SNP）的筛选。
　　RAC1基因Tag-SNPs位点基因型分析：选择华中科技大学同济医学院附属协和医院和同济医院2014年2月至3月门诊行免疫抑制药血药浓度监测的器官移植患者619例（314例肾移植患者及305例非肾移植患者），及同时期武汉协和医院健康体检志愿者1168例。采用实时荧光TaqMan-MGB探针等位基因分型技术进行RAC1基因上Tag-SNP位点基因型检测。采用SPSS17.0软件统计等位基因、基因型在各试验组中的分布特征、差异。运用Helpoview软件进行连锁不平衡分析。
　　RAC1 mRNA的相对表达量研究：按照各组间年龄和性别比匹配原则，以及各SNPs位点的三种基因型数目匹配原则（如健康组rs10951982三种基因型的数目分别为GG-681、AG-53、AA-434，则GG、AG、AA基因型下各选择50例人数），筛选出332例健康志愿者、164例肾移植患者和164例非肾移植患者（包括肝脏、心脏、骨髓移植）进行RAC1mRNA和蛋白含量测定。采用Trizol法进行mRNA提取，以β-actin为内参基因进行RAC1 mRNA相对表达量测定。Ct值代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数，统计分析时用2-ΔCt代表基因的相对表达量。每一样品设置三个复孔，ΔCt=目的基因平均Ct值–内参基因平均Ct值。采用SPSS17.0软件统计RAC1 mRNA的相对表达量在健康组、肾移植组和非肾移植组间的分布差异，并分析年龄、性别和基因型对RAC1 mRNA相对表达量的影响。用t检验分析两组正态分布资料间的差异，单因素方差检验分析三组正态分布资料间的差异，检验水准α=0.05，以P<0.05表示差异有统计学意义。
　　Rac1总蛋白和Rac1-GTP活性蛋白的定量研究：同RAC1 mRNA的相对表达量研究，本部分试验采用酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）提取测定了332例健康志愿者、164例肾移植患者和164例非肾移植患者（包括肝脏、心脏、骨髓移植）血浆中的Rac1总蛋白和Rac1-GTP活性蛋白含量水平。每一样品设置三个复孔，测定每个样本孔在450 nm波长处的光吸收值（OD），用平均值表示Rac1总蛋白和Rac1-GTP活性蛋白含量水平。采用SPSS17.0软件统计Rac1总蛋白和Rac1-GTP活性蛋白含量水平在健康组、肾移植组和非肾移植组间的分布差异，并分析年龄、性别和基因型对Rac1总蛋白和Rac1-GTP活性蛋白含量水平的影响。用 t检验分析两组正态分布资料间的差异，单因素方差检验分析三组正态分布资料间的差异，检验水准α=0.05，以P<0.05表示差异有统计学意义。
　　[结果] RAC1基因多态性研究结果：本研究入选的各组受试者年龄、性别分布相当，具有可比性。Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果显示 rs836488、rs702482、rs10951982、rs702483、rs69549966、rs9374各位点基因型的分布频率符合遗传平衡（P>0.05），说明本部分试验样本的选取能够代表中国湖北地区人群基因多态性的特点。本研究选择的6个SNPs位点的基因型和等位基因在健康组、肾移植组和非肾移植组三组间的分布趋势相同，差异无统计学意义（P>0.05）。且本研究中的所有位点的最小等位基因频率（Minimum allele frequency，MAF）与数据库中北京汉族人群的MAF相似，也与已有文献报道的中国人群的MAF接近。运用Helpoview软件进行连锁不平衡分析显示rs836488与rs702482（r2=0.955），rs10951982与rs9374（r2=0.908）为高度连锁不平衡，rs702483、rs6954996与其它位点之间相互独立。因此从rs836488、rs702482、rs10951982、rs702483、rs6954996、rs9374这6个SNPs位点中筛选出了人4个Tag-SNPs位点： rs702482、rs10951982、rs702483、rs6954996。
　　RAC1基因Tag-SNPs位点基因型分析：本研究入选的各组受试者年龄、性别分布相当，具有可比性。Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果显示Tag-SNPs各基因型的分布频率符合遗传平衡（P>0.05），说明本部分样本的选取能够代表中国湖北地区人群基因型分布特点。这4个Tag-SNPs的基因型、等位基因在健康组、肾移植组和非肾移植组三组间的分布趋势相同，差异无统计学意义（P>0.05）。将健康组、肾移植组、非肾移植组进行两两比较，应用非条件Logistic回归分析计算基因型间和等位基因间相对风险度的比值比OR及其95％可信区间，各组间比较所得P值均大于0.05，暗示rs702482、rs10951982、rs702483、rs6954996多态性分布与试验分组无关联，所选定的4个Tag-SNPs位点的基因多态性可能与相关器官实质性病变或慢性肾功能衰竭导致尿毒症（肾移植术主要适应证）发病风险无关。
　　RAC1 mRNA的相对表达量研究结果：本研究入选的各组受试者年龄、性别分布相当，具有可比性。代表RAC1 mRNA的相对表达量的2-ΔCt值为非正态分布，将原始结果进行取对数转换后 Log2-ΔC满足正态分布。本研究结果表明：RAC1基因 mRNA相对表达量在健康组、肾移植组和非肾移植组三组间的差异无统计学意义（P>0.05），推测RAC1 mRNA表达量可能与相关器官实质性病变或慢性肾功能衰竭导致尿毒症（肾移植术主要适应证）发病无关。RAC1 mRNA表达量与性别和年龄无关（P>0.05）。基因型-mRNA相关性研究显示：健康人群rs6954996-AA基因型携带者RAC1 mRNA表达水平比另两种基因型AG、GG携带者的RAC1 mRNA表达水平低，其中AA与GG之间的mRNA表达水平差异有统计学意义（P<0.05）；非肾移植人群rs10951982-AA基因型携带者的RAC1 mRNA表达水平比另两种基因型AG、GG携带者的RAC1 mRNA表达水平高，其中AA与GG之间的mRNA表达水平差异有统计学意义（P<0.05）；健康人群rs702482-TT基因型携带者的RAC1mRNA表达水平显著低于另两种基因型AT、AA携带者的RAC1mRNA表达水平（P<0.05）；但是非肾移植人群 rs702482-TT基因型携带者的RAC1 mRNA表达水平显著高于另两种基因型AT、AA携带者的RAC1mRNA表达水平（P<0.05）。本研究推测在健康人群中，rs702482-TT和rs6954996-AA可能为导致RAC1基因转录的mRNA表达下调的基因型；而在非肾移植人群中，rs10951982-AA和rs702482-TT中可能为导致RAC1基因转录的mRNA表达上调的基因型。
　　Rac1总蛋白的定量研究结果：本研究入选的各组受试者年龄、性别分布相当，具有可比性。由于结果为非正态分布，将原始结果进行取对数转换后满足正态分布。本研究得出健康组的Rac1总蛋白含量水平显著高于肾移植组和非肾移植组（P<0.05），而肾移植组和非肾移植组间总Rac1蛋白含量水平差异无统计学意义（P>0.05）。女性的Rac1总蛋白含量水平普遍高于男性，特别是在肾移植组和非肾移植组两组中，这种性别间的差异有显著的统计学意义（P<0.05）。Rac1总蛋白含量水平与年龄无显著相关性（P>0.05，R2<0.1）。肾移植人群rs702482-AA基因型携带者的Rac1总蛋白含量水平显著低于基因型rs702482-AT携带者的Rac1总蛋白含量水平（P<0.05）；非肾移植人群 rs702483-AA基因型携带者的Rac1总蛋白含量水平显著低于基因型rs702483-AG携带者的Rac1总蛋白含量水平低（P<0.05）。其它基因型则未观察到与Rac1总蛋白含量水平有相关性（P>0.05）。
　　Rac1-GTP活性蛋白的定量研究结果：本研究入选的各组受试者年龄、性别分布相当，具有可比性。由于结果为非正态分布，将原始结果进行取对数转换后满足正态分布。本研究得出健康组的Rac1-GTP活性蛋白含量水平显著高于肾移植组和非肾移植组（P<0.05），而肾移植组和非肾移植组间总Rac1-GTP活性蛋白含量水平差异无统计学意义（P>0.05）。女性的Rac1-GTP活性蛋白含量水平普遍高于男性，特别是在健康组和肾移植组两组中，这种性别间的差异有显著的统计学意义（P<0.05）。Rac1-GTP活性蛋白含量水平与年龄无显著相关性（P>0.05，R2<0.1）。健康组
　　rs10951982-AA基因型携带者的Rac1-GTP活性蛋白含量水平显著低于另两种基因型AG、GG携带者的Rac1-GTP活性蛋白含量水平（P<0.05）；健康组rs702482-AT基因型携带者的Rac1-GTP活性蛋白含量水平显著高于另两种基因型AA、TT携带者的Rac1-GTP活性蛋白含量水平（P<0.05）；非肾移植组rs10951982-AA基因型携带者的Rac1-GTP活性蛋白含量水平显著低于rs10951982-AG基因型携带者的Rac1-GTP活性蛋白含量水平（P<0.05）；非肾移植组rs702483-AA基因型携带者的Rac1-GTP活性蛋白含量水平显著低于rs702483-AG基因型携带者的Rac1-GTP活性蛋白含量水平（P<0.05）；其它基因型则没有观察到与Rac1-GTP活性蛋白含量水平有相关性（P>0.05）。
　　[结论]本研究首次在中国湖北地区健康人群和器官移植人群中进行了RAC1基因型，及其转录的mRNA表达水平和蛋白活性研究。本研究测定分析了RAC1基因上6个SNPs位点、RAC1 mRNA、Rac1总蛋白以及Rac1-GTP活性蛋白在上述人群中的分布特征，并进行了基因型-表型的相关性研究。根据研究结果可以得出以下几点结论：
　　1）RAC1基因上6个SNPs位点rs836488、rs702482、rs10951982、rs702483、rs6954996、rs9374的等位基因和基因型在健康组、肾移植组和非肾移植组中的分布无统计学差异（P>0.05）。此研究为湖北汉族人群RAC1基因多态性提供了相关数据，进一步扩大了中国不同地区人群中RAC1基因多态性数据库资料。
　　2）RAC1 mRNA相对表达量在健康人群、肾移植人群和非肾移植人群间差异无统计学意义（P>0.05），推测RAC1 mRNA表达量可能与相关器官实质性病变或慢性肾功能衰竭导致尿毒症（肾移植术主要适应证）发病无关。健康人群的Rac1总蛋白和Rac1-GTP活性蛋白含量水平都显著高于肾移植人群和非肾移植人群（P<0.05），而器官移植人群间Rac1总蛋白和Rac1-GTP活性蛋白含量水平没有显著性差异（P>0.05），考虑为器官移植人群的用药抑制了Rac1蛋白的活性。
　　3）RAC1 mRNA表达量与性别无相关性（P>0.05）。而女性的Rac1总蛋白和Rac1-GTP活性蛋白含量水平普遍高于男性（P<0.05）。
　　4）RAC1 mRNA、Rac1蛋白和Rac1-GTP活性蛋白含量水平与年龄无显著相关性（P>0.05，R2<0.1）。
　　5）基因型-表型相关性研究：部分基因型与RAC1mRNA、蛋白表达量相关（P<0.05），而mRNA与蛋白水平之间没有相关性（P>0.05）。对于rs702482，健康组TT基因型携带者的RAC1 mRNA表达量比其它基因型携带者低，但是非肾移植组TT基因型携带者的RAC1 mRNA表达量比其它基因型携带者高；肾移植组AA基因型携带者的Rac1总蛋白含量水平比其它基因型携带者低；健康组 AT基因型携带者的Rac1-GTP活性蛋白含量水平比其它基因型携带者高。对于rs10951982，健康组和非肾移植组AA基因型携带者的Rac1-GTP活性蛋白含量水平比其它基因型携带者低；但是非肾移植组AA基因型携带者的RAC1 mRNA表达量比其它基因型携带者高。对于rs702483，非肾移植组AA基因型携带者的Rac1总蛋白和Rac1-GTP活性蛋白含量水平显著低于AG基因型携带者。对于rs6954996，健康组AA基因型携带者的RAC1 mRNA表达量比其它基因型携带者低。

目录

封面

声明

目录

中英文缩略词对照表

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分 RAC1基因多态性测定及Tag-SNP位点的筛选

1．引言

2．试验对象与材料

3．试验步骤与方法

4．试验结果

5．讨论与小结

第二部分RAC1基因Tag-SNPs位点基因型分析

1．引言

2．试验对象与材料

3．试验步骤与方法

4．试验结果

5．讨论与小结

第三部分 RAC1基因转录mRNA表达及与基因型相关性分析

1．引言

2．试验对象与材料

3．试验步骤与方法

4．试验结果

5．讨论与小结

第四部分 Rac1总蛋白表达及与基因型相关性分析

1．引言

2．试验对象与材料

3．试验步骤与方法

4．试验结果

5．讨论与小结

第五部分 Rac1-GTP活性蛋白表达及与基因型相关性分析

1．引言

2．试验对象与材料

3．试验步骤与方法

4．试验结果

5．讨论与小结

总结与展望

参考文献

综述: RAC1基因遗传多态性研究进展[1]

附件1 攻读学位期间发表论文目录

致谢