蛋氨酸亚砜还原酶A在原代培养大鼠小胶质细胞炎性激活中的作用及其机制

摘要

本文主要从以下几个方面进行论述:
　　第一部 分蛋氨酸亚砜还原酶A在小胶质细胞炎性激活中的作用
　　目的：蛋氨酸亚砜还原酶A（Methionine sulfoxide reductase A，MsrA）是蛋氨酸亚砜还原酶家族的重要成员之一，近年来由于其在体内氧化还原过程中的作用受到了广泛关注。MsrA表达于高等动物的多数组织中，在心脏、肝脏等组织中表达尤为丰富。在中枢神经系统中，MsrA在包括海马、皮层、中脑等在内的多个脑区中均有分布。MsrA可以修复发生氧化损伤的蛋白，减缓氧化应激，对包括神经元在内的多种细胞具有神经保护作用。迄今为止，关于MsrA在小胶质细胞中的表达及其功能鲜有文献报道。鉴于氧化应激在小胶质细胞过度激活及神经炎症中的重要作用，本部分实验旨在研究小胶质细胞中是否存在MsrA表达，以及MsrA是否对脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）诱导的小胶质细胞激活及其介导的炎症反应具有调控作用。
　　方法：通过RT-PCR技术在mRNA水平确定原代培养的大鼠小胶质细胞中是否存在MsrA mRNA表达；通过Western blotting方法在蛋白质水平确定原代培养的大鼠小胶质细胞中是否存在MsrA蛋白表达；通过对原代培养的大鼠小胶质细胞和大鼠脑片进行免疫荧光标记，在形态学水平确定小胶质细胞中是否存在MsrA的表达以及MsrA的分布情况；利用慢病毒转染技术研究MsrA沉默对于LPS诱导的小胶质细胞激活及其介导的炎症反应的影响；通过转导基因重组Tat-大鼠源性MsrA融合蛋白（Tat-rMsrA fusion protein，Tat-rMsrA）外源性补充小胶质细胞中的MsrA，研究MsrA上调对于LPS诱导的小胶质细胞激活及其介导的炎症反应的影响；利用大鼠急性神经炎症模型，在动物水平研究Tat-rMsrA转导对于小胶质细胞激活以及神经炎症的影响。
　　结果：（1）从mRNA水平和蛋白质水平分别证实原代培养的大鼠小胶质细胞中存在MsrA的表达，免疫荧光证实MsrA在小胶质细胞的胞浆和胞核中均有分布；（2）LPS可诱导小胶质细胞中的MsrA表达上调；（3）慢病毒沉默小胶质细胞中的MsrA可加剧LPS诱导的小胶质细胞激活及其介导的炎症反应；（4）向小胶质细胞中转导基因重组透膜性蛋白Tat-rMsrA可抑制LPS诱导的小胶质细胞激活及其介导的炎症反应；（5）在大鼠急性神经炎症模型中，向海马齿状回区域注射Tat-rMsrA可抑制LPS诱导的小胶质细胞激活以及致炎因子的产生。
　　结论：小胶质细胞中存在MsrA的功能性表达，且MsrA可负性调控LPS诱导的小胶质细胞激活及其介导的炎症反应。
　　第二部分 蛋氨酸亚砜还原酶A负性调控小胶质细胞炎性激活的机制
　　目的：小胶质细胞介导的炎症反应和活性氧（reactive oxygen species，ROS）密切相关。ROS可以作为“信号分子”激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）以及核因子-κB（nuclear-factor kappa B，NF-κB）等在小胶质细胞介导的免疫和炎症反应中发挥关键作用的信号级联反应，从而加剧小胶质细胞的异常活化以及炎症反应。因此，内源性的抗氧化系统可能是炎症反应加剧时重要的“刹车”机制。已有研究报道蛋氨酸氧化-还原循环在清除ROS以及保护蛋白质的关键位点免受ROS攻击的过程中扮演重要角色，而MsrA是调控蛋氨酸抗氧化防御系统的关键酶，因此，本部分实验旨在研究小胶质细胞中的MsrA能否通过催化ROS和蛋氨酸（methionine，Met）反应清除LPS诱导的ROS生成，并进而抑制MAPKs以及NF-κB等信号通路，从而减缓LPS诱导的小胶质细胞激活及其介导的炎症反应。
　　方法：通过western blotting方法检测转导基因重组透膜性蛋白Tat-rMsrA对于LPS诱导的p38、细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、c-jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）以及核因子-κB抑制因子α（inhibitor of kappa Bα，IκBα）磷酸化的影响；通过细胞免疫荧光技术研究转导基因重组透膜性蛋白Tat-rMsrA对于LPS诱导的NF-κB的p65亚基入核的影响；通过胞内自由基检测以及胞外超氧化物测定等方法研究转导基因重组透膜性蛋白Tat-rMsrA对于LPS诱导的ROS生成的影响；并通过电子自旋共振（electron spin resonance，ESR）、鲁米诺化学发光检测以及蛋氨酸亚砜检测等技术研究Tat-rMsrA清除ROS的作用机制。
　　结果：（1）向小胶质细胞中转导基因重组透膜性蛋白Tat-rMsrA可抑制LPS诱导的小胶质细胞中p38、ERK等MAPKs信号通路的激活；（2）向小胶质细胞中转导基因重组透膜性蛋白Tat-rMsrA可抑制LPS诱导的小胶质细胞中NF-κB信号通路的激活；（3）向小胶质细胞中转导基因重组透膜性蛋白Tat-rMsrA可减缓小胶质细胞激活所引起的氧化应激；（4）MsrA可通过催化L-蛋氨酸或蛋白质中的蛋氨酸残基和ROS反应生成蛋氨酸亚砜（methionine sulfoxide，MetO），从而发挥自由基清除作用。
　　结论：MsrA可通过催化蛋氨酸和ROS反应，减少LPS诱导的ROS生成，并进一步抑制p38、ERK以及NF-κB等信号级联反应的激活，从而减缓LPS诱导的小胶质细胞激活及其介导的炎症反应。

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前言

第一部分 蛋氨酸亚砜还原酶A在小胶质细胞炎性激活中的作用

一. 材料与方法

二．结果

三．讨论

小结

第二部分 蛋氨酸亚砜还原酶A负性调控小胶质细胞炎性激活的机制

一、材料与方法

二、结果

三. 讨论

小结

全文总结

本文创新点

展望

参考文献

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