TIF1γ和Smad4分别通过竞争和协同的方式来调控结直肠癌生长和肝转移

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分 TIF1γ和Smad4对结直肠癌细胞生物学行为的影响
　　目的：通过构建TIF1γ或/和Smad4敲减、TIF1γ敲减或/和Smad4恢复表达的稳定结直肠癌细胞系，来研究这些细胞在生长、迁移、侵袭和肝转移等方面的变化，从而来探讨TIF1γ和Smad4各自在结直肠癌发生发展中的作用。
　　方法：利用逆转录病毒构建TIF1γ或Smad4敲减的稳定结肠癌细胞系，利用慢病毒构建Smad4过表达的结肠癌细胞系。用CCK8细胞增殖实验、平板克隆形成试验和软琼脂克隆形成试验来评估肿瘤细胞的增殖能力。用裸鼠皮下成瘤模型来评定肿瘤细胞在体内的成瘤能力，并结合皮下瘤的ki67染色来评定肿瘤细胞的体内增殖能力。用细胞划痕试验、Transwell细胞迁移、侵袭和穿血管内皮迁移实验来判定肿瘤细胞在体外的迁移、侵袭与穿血管能力。利用实验性结直肠癌肝转移模型来评定肿瘤细胞的体内转移能力。
　　结果：敲减Smad4表达后能明显促进肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、穿血管及肝转移能力；过表达Smad4后明显抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、穿血管及肝转移能力。敲减TIF1γ后明显抑制肿瘤细胞的增殖，无论有无Smad4表达，但是明显促进肿瘤细胞的迁移、侵袭、穿血管及肝转移能力。在有Smad4表达的细胞系CT26和HCT116，同时敲减TIF1γ和Smad4后对肿瘤细胞的增殖无明显影响，但却协同性地促进肿瘤细胞的迁移、侵袭、穿血管及肝转移能力。在Smad4表达缺失的细胞系SW620，同时敲减TIF1γ和过表达Smad4后会进一步抑制肿瘤细胞的增殖。
　　结论：TIF1γ和Smad4反向控制结直肠癌细胞的增殖，协同地抑制结直肠癌细胞的迁移、侵袭及肝转移。
　　第二部分 TIF1γ和Smad4竞争性地反向调控结直肠癌的生长，协同地抑制结直肠癌的迁移、侵袭和肝转移
　　目的：研究TIF1γ和Smad4通过哪些可能的机制来调控结直肠癌细胞的增殖、成瘤、迁移、侵袭和转移。
　　方法：首先应用CCK8细胞增殖实验、平板克隆形成试验和软琼脂克隆形成试验等功能学实验来初步分析TIF1γ和Smad4是否依赖TGF-β/Smad通路来调控结直肠癌细胞的增殖效应；利用细胞划痕损伤修复试验、细胞迁移、侵袭和穿血管内皮迁移实验等功能学实验来分析TIF1γ和Smad4是否依靠TGF-β通路来协同调控结直肠癌细胞的迁移、侵袭和肝转移能力。接着利用荧光素酶报告基因转录分析实验和蛋白免疫共沉淀实验来分析TIF1γ和Smad4是否影响及如何影响TGF-β/Smad信号通路的激活。应用流式检测细胞周期实验来检测TIF1γ和Smad4对细胞周期的调控；同时利用Western blotting来分析TIF1γ或/和Smad4敲减，TIF1γ敲减或/和Smad4过表达后TGF-β调控下的哪些通路发生了改变；哪些与增殖、迁移、转移相关的蛋白表达水平或活性水平发生了改变。
　　结果：在结肠癌细胞增殖方面，在Smad4有表达的细胞系，敲减TIF1γ后会增强TGF-β对肿瘤细胞的增殖抑制作用；而敲减Smad4或同时敲减TIF1γ和Smad4不影响TGF-β对肿瘤细胞增殖的作用。在Smad4表达缺失的细胞系，敲减TIF1γ不影响TGF-β对肿瘤细胞增殖的作用，但过表达Smad4会增强TGF-β对肿瘤细胞的增殖抑制作用；同时敲减TIF1γ和过表达Smad4能进一步增强TGF-β对肿瘤细胞的增殖抑制作用。在侵袭转移方面，在Smad4有表达的细胞系，敲减TIF1γ或/和Smad4不影响TGF-β对肿瘤细胞迁移和侵袭的作用。在Smad4表达缺失的细胞系，过表达Smad4能增强TGF-β对肿瘤细胞迁移和侵袭的抑制作用；而敲减TIF1γ或敲减TIF1γ联合过表达Smad4的细胞不影响TGF-β对肿瘤细胞迁移和侵袭的作用。在机制方面，荧光素酶报告基因转录分析实验示TIF1γ和Smad4在TGF-β/Smad信号通路里面发挥着独立的信号传导功能。蛋白免疫共沉淀实验示TIF1γ和Smad4彼此相互竞争性地与活化的Smad2/3复合物结合形成两个不同的复合物。流式检测细胞周期示Smad2/3-Smad4复合物介导TGF-β依赖性的细胞周期G0/G1期阻滞，Smad2/3-TIF1γ复合物介导TGF-β依赖性的细胞周期促进作用。Western blotting示：敲减TIF1γ后明显抑制c-Myc蛋白水平，增加p21、p27蛋白水平，抑制CyclinA2蛋白水平；而敲减Smad4后结果刚好相反。同时敲减TIF1γ和Smad4后对上述蛋白表达影响不大。Western blotting还显示：敲减TIF1γ或Smad4后明显激活MEK/ERK通路和上调MEK/ERK通路依赖性的侵袭转移相关分子MMP9、COX-2、Nm23和uPA的蛋白水平；同时敲减TIF1γ和Smad4后上述改变更加明显。
　　结论：TIF1γ和Smad4竞争性通过TGF-β/ Smad通路反向调控细胞周期相关蛋白来调控细胞增殖，却协同地通过TGF-β/Smad旁路来间接抑制活化的MEK/ERK通路，进而下调侵袭转移相关分子的蛋白水平，进而协同抑制结肠癌细胞的迁移侵袭和肝转移。
　　第三部分 TIF1γ和Smad4在结直肠癌中的表达与结直肠癌预后的关系
　　目的：探讨TIF1γ和Smad4在结直肠癌组织中的表达差异与结直肠癌患者临床病理因素及术后预后的关系，从临床角度进一步验证TIF1γ和Smad4在细胞和动物水平的功能。
　　方法：先用组织化学染色技术和western blotting检测结直肠癌病人的原发瘤标本、肝转移标本及正常结直肠组织标本中TIF1γ、Smad4和磷酸化ERK的表达情况。再结合临床病理和随访资料对TIF1γ、Smad4和磷酸化ERK表达差异与相关危险因素及手术预后的评价。同时分析TIF1γ、Smad4和磷酸化ERK表达水平的相关性。
　　结果：与正常结直肠组织比较，TIF1γ的表达水平在TNM-Ⅰ和Ⅱ期结直肠癌组织中上调，在TNM-Ⅲ和Ⅳ期结直肠癌组织中明显下调。而Smad4的表达水平在结直肠癌组织中的表达明显低于正常结直肠组织，并且随着肿瘤TNM分期的增加而逐步下调。TIF1γ和Smad4的表达水平均随着结直肠癌分化程度的恶化而下降。结合临床病理资料分析，降低的TIF1γ表达与恶性分化、更高的TNM分期、淋巴血管侵犯和远处转移相关，尤其是与肝转移密切相关。结合随访资料的生存分析示TIF1γ或Smad4低表达的病人通常有着明显缩短的无瘤生存时间和总体生存时间；而TIF1γ和Smad4同时低表达的病人通常有更短的无瘤生存时间和总体生存时间。单因素和多因素分析示TIF1γ可以作为结直肠癌根治术后评判预后的一个独立的且有显著性意义的预后因子。同时发现TIF1γ和Smad4在肝转移结直肠癌的表达水平明显低于在结直肠癌原发瘤的表达水平，而磷酸化ERK的表达水平恰好相反。Spearman's相关系数分析示TIF1γ和Smad4在肝转移结直肠癌的表达水平与磷酸化ERK的表达水平呈显著性负相关。肝转移结直肠癌中TIF1γ低表达与恶性分化、多发的肝转移灶和缩短的无肝转移间期明显相关。结合病人随访资料的生存分析示TIF1γ低表达加上磷酸化ERK高表达预示着更早更多的肝转移。单因素和多因素分析示TIF1γ和Smad4可以作为结直肠癌根治术后评判肝转移的一个独立的且有显著性意义的预测因子。
　　结论：TIF1γ或/和Smad4在进展期的原位结直肠癌组织低表达预示着较差的预后；肝转移结直肠癌中TIF1γ和Smad4低表达、磷酸化ERK高表达与结直肠癌更早的肝转移明显相关。

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缩略词表

前言

参考文献

第一部分 TIF1γ和Smad4 对结直肠癌细胞生物学行为的影响

中文摘要

英文摘要

1.引言

2.材料和方法

3.结果

4.结论

5.讨论

参考文献

第二部分TIF1γ和Smad4 竞争性地反向调控结直肠癌的生长，协同地抑制结直肠癌的迁移、侵袭和肝转移

中文摘要

英文摘要

1. 引言

2.材料和方法

3. 实验结果

4. 结论

5. 讨论

参考文献

第三部分 TIF1γ和Smad4 在结直肠癌中的表达与结直肠癌预后的关系

中文摘要

英文摘要

1.引言

2.材料和方法

3.实验结果

4.结论

5.讨论

参考文献

综述

参考文献

附录

致谢