WHV表面抗原的制备及其在WHV表面抗体检测中的应用

摘要

目的：
　　WHV感染的土拨鼠/旱獭模型被广泛用于慢性乙型肝炎的发病机理（包括免疫发病机制）研究、抗病毒药物及治疗策略的评估。然而WHV表面抗原（WHsAg）和表面抗体（WHsAb）的检测还有待进一步完善。本研究尝试通过酵母真核表达系统表达WHsAg并从WHsAg阳性旱獭血清中分离纯化WHsAg，探索WHsAg在WHV表面抗体检测中的应用。
　　方法：
　　1.构建带有His标签的WHsAg酵母表达重组质粒PPIC3.5K-WHs-His，挑选阳性克隆进行序列测定证实，线性化WHsAg酵母表达重组质粒，电转至GS115酵母菌，PCR筛选阳性的酵母转化子后，通过甲醇诱导WHsAg的表达，SDS-PAGE和Western-blot分析重组WHsAg的表达。
　　2.蔗糖密度梯度离心WHsAg阳性的旱獭血清，通过ELISA检测收集WHsAg阳性组分；将WHsAg组分通过肝素亲和层析柱，通过Bradford检测收集蛋白阳性组分；将蛋白阳性组分经过MILLIPORE脱盐浓缩后经琼脂糖蛋白A柱吸附，通过SDS-PAGE分析IgG等免疫球蛋白去除的效果，获得初步纯化的来源于血清的WHsAg。以初步纯化的WHsAg作为包被抗原，建立WHsAb间接ELISA检测方法，将其初步应用于WHV感染旱獭血清WHsAb的检测。
　　结果：
　　1.成功构建了带有His标签的WHsAg重组酵母表达质粒PPIC3.5K-WHs-His，获得WHsAg重组表达质粒酵母转化子GS115-PPIC3.5K-WHs-His，通过甲醇诱导后未能在GS115胞内和上清中检测到重组WHsAg的表达。
　　2.通过蔗糖密度梯度离心、肝素亲和层析和蛋白A吸附获得血清来源WHsAg，经SDS-PAGE分析可见p24和gp27WHV小表面抗原（SWHsAg）、p41WHV中表面蛋白（MWHsAg），在70KDa左右出现杂带，可能为土拨鼠白蛋白条带。以2.5μg/ml的纯化WHsAg作为包被抗原，建立的WHsAb间接ELISA检测法，能将WHsAg阴性旱獭血清的背景值从0.426降低至0.096，应用于WHV感染旱獭血清WHsAb检测能明显减少假阳性，提高了旱獭血清WHsAb检测的特异性。
　　结论：
　　1.携带单拷贝WHsAg重组酵母表达质粒转化至GS115酵母菌后未能诱导WHsAg的表达，下一步将尝试通过调整酵母表达载体、酵母菌株及构建多拷贝WHsAg酵母表达载体尝试获得真核表达的WHsAg。
　　2.通过密度梯度离心、肝素亲和层析和蛋白A吸附成功获得血清来源的WHsAg。基于血清来源WHsAg建立的WHsAb ELISA检测法能明显提高WHsAb检测的特异性。
　　创新点：
　　1、首次通过密度梯度离心、肝素亲和层析和蛋白A吸附从WHsAg阳性旱獭血清分离纯化WHsAg。
　　2、以血清来源WHsAg作为包被抗原建立的间接ELISA明显提高旱獭血清WHsAb检测的特异性。

目录

封面

声明

目录

缩写名词中英文对照表

中文摘要

英文摘要

绪论

参考文献

第一部分WHsAg酵母表达系统的构建及其诱导表达

材料和方法

实验结果

讨论

参考文献

第二部分血清来源WHsAg的制备及其在WHsAb检测中的应用

材料和方法

实验结果

讨论

参考文献

综述

参考文献

致谢