Flp/FRT重组系统介导的线虫神经元特异性基因表达

摘要

线虫神经系统的研究一直是神经生物学所感兴趣的，由于它的遗传学研究在各种生物过程的分析中起到至关重要的作用。
　　多层次的分析被用于从分子和细胞阶段到系统和认知水平的研究。这些多层次分析一直是可能的，因为多细胞生物线虫的基因组测序工作已于1998年完成。这进一步促进了对线虫神经系统中神经发育的遗传基础以及神经功能分子机制的研究。
　　同样，神经科学最近的研究核心是基因表达体系的建立，这在线虫中也能实现。对于行为的多样性，基因在产生自然变异的神经系统发育中具有重要作用，这些不同基层的行为状态是由神经回路中神经元的功能特性的改变所造成的。
　　位点特异性重组酶FLP是有效、简单并且具有吸引力的基因操作工具之一，并且在很多物种中都被证明了具有生物活性。FLP/frt重组系统也被应用于一些物种的基因组文库的构建，例如细菌、酵母、昆虫、植物、老鼠和人类。FLP作用于FLP重组位点frt并且催化重组反应，它也被应用于许多控制基因结构和表达的系统中，而且已经成为研究人员的一个有力的工具。我们知道AVA属于命令中间神经元，它通过整合主要来自于一些头部感觉神经元和其它后退命令神经元（如：AVD,AVE）的信号，而成为线虫后退运动的潜在的诱导神经元。在我们研究中，通过FLP/frt重组系统的应用，特异性的标记了AVA命令中间神经元，同时也用相同的方法标记了AVE命令神经元。
　　我们使用两种特异性的启动子，每一种启动子分别表达在一类神经元中，它们的交集只有一个单神经元。其中一个启动子驱动FLP重组酶的表达，另一个启动子驱动frt-stop-frt::GFP，当FLP与frt-stop-frt::GFP同时表达时，FLP会切除stop序列，从而使标记蛋白GFP表达。通过上面的方法，我们可以将特异性功能的基因与GFP蛋白表达成融合蛋白，从而控制神经元的激活，失活状态或者功能缺失性恢复，进一步研究单个特异性神经元在线虫某一种行为中所起的作用。

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Chapter One Introduction

1. General principles

1.1 Site-specific recombinase, flipase \(flp\) and its recognition

1.2 The FLP/frt system control gene structure and expression

1.3 FLP/FRT recombination system is applicable to C.elegans

1.4 Sl2 Trans splicing factor in C.elegans

1.5 The nematode worm Caenorhabditis Elegans is an Essential Model for Study

1.6 C. Elegans as a Genetic Model Organism

1.7 C. Elegans Nervous System Development and organization

1.8 interneurons and its roles in complex behaviors regulation

1.9 FMRFamide-like peptides in C. elegans.

Chapter Two Materials and Methods

2. Technology

2.1 The In-Fusion PCR Cloning Method

2.2. In-fusion Method

2.3 LR Recombination Reaction Procedure

2.4 Plasmid Microinjection

2.5 Imaging by Laser confocal microscopy

Chapter Three Results

Conclusion

致谢

参考文献

Abbreviations