FLP/frt位点特异性重组系统在玉米中的应用及转TsVP抗旱玉米的获得

摘要

干旱和盐渍已经成为限制世界农作物增产的主要原因。随着人口增长和对生物质能源的迫切需求，增加作物产量已成为当务之急，利用生物技术培育耐盐抗旱作物品种具有重要的战略意义。玉米(Zea mays L.)是世界上重要的粮食、饲料兼能源作物，也是重要的工业原料。玉米需水较多、对干旱比较敏感，耐盐性差，低度盐碱可使其产量大幅度减少。采用传统的育种方法因缺乏种质资源等因素很难获得玉米耐盐抗旱新品种，基因工程的发展加快了玉米育种工作前进的步伐，为培育玉米耐盐、抗旱新品种开辟了新途径。目前，玉米耐盐、抗旱基因工程研究尚处在初级阶段，受到国内外玉米育种工作者的关注。 随着转基因作物播种面积的快速增长，用以筛选转基因植物的选择标记基因(如抗生素抗性基因、除草剂抗性基因等)的使用引发了人们对转基因植物安全性的隐忧，影响了消费者对转基因产品的接受程度，也不利于对同一个品种进行多次转基因操作。因此，培育无选择标记基因或具有安全选择标记基因的转基因作物倍受重视。来自于啤酒酵母2μm质粒的FLP/frt位点特异性重组系统中重组酶FLP可催化位于同一分子上两个同向frt位点间DNA片段的切除，利用该系统可实现植物转基因细胞筛选完成后选择标记基因的删除。 基于对上述问题的考虑，本研究开展了采用FLP/frt位点特异性重组系统删除转基因玉米中选择标记基因的工作，对其删除效率进行了分析，并对提高删除效率的策略进行了探讨。本工作不仅培育出了耐盐抗旱的无选择标记的转基因优良玉米新材料，而且为批量获得无选择标记基因的转基因玉米提供了成套技术。 主要结果和结论如下： 适合于单子叶植物的FLP/frt位点特异性重组系统的构建和应用本工作通过多轮DNA重组实验构建出适合单子叶转基因植物去除选择标记基因的定点重组系统，包括适合于单子叶植物的FLP/frt位点特异性重组系统和热诱导型FLP/frt位点特异性重组系统。本工作中，为了提高在转基因植物中的重组效率，在FLP重组酶基因编码区起始密码子ATG前添加了植物最适翻译修饰序列AACA；在含有frt位点的植物表达载体中位于选择标记基因als两侧的frt位点，一个是全长序列，另一个为仅包含核心重组序列的截短的frt位点(frtm)。在构建适合于单子叶植物的FLP/frt位点特异性重组系统时，分别以水稻Actinl启动子启动AtNHX1基因、以玉米泛素ubiquintin基因启动子Ubi启动TsVP和FLP基因的转录，以期转基因能在玉米中高效表达。为了提高选择标记基因的删除效率，使FLP重组酶能够在玉米植株中于特定时期发挥作用，减少重组酶的过量及长期表达对植株的伤害，我们又构建了热诱导型FLE/frt位点特异性重组系统。在该系统中，FLP重组酶基因由热诱导启动子hsp启动，使其在热激条件下能够特异表达。利用农杆菌介导法获得了分别转FLP重组酶基因、AtNHX1及als基因、TsVP及als基因的转基因植株，通过连续自交得到了稳定的转基因纯合系。利用这些转基因纯合系进行选择标记基因删除实验。在有性杂交去除选择标记基因途径中，检测到选择标记基因的删除频率为40.35％，其中以携带FLP重组酶基因的植株为母本进行有性杂交得到的F1植株中选择标记被删除的频率略高于以其作为父本的，而且als基因被删除的结果可以稳定遗传到后代。对F1植株中FLP重组酶的稳定性研究发现，当F1植株与带有frt位点的转基因植株杂交后，子代植株中的重组酶基因FLP仍然可以发挥功能，作用于frt位点介导重组事件的发生。当细胞内导入两对frt位点及选择标记基因时，只在20％左右的植株中检测到选择标记基因被完全删除，即选择标记基因被完全删除的频率大幅度降低。 分别以转AtNHX1及als基因的植株和转hap启动的FLP重组酶基因的植株为父、母本进行有性杂交，然后通过原位果穗热激和未成熟胚离体培养热激两种方式诱发选择标记基因的删除并进行删除频率的比较。前一方式是在授粉后不同时间进行热激处理，以授粉后24h在42℃下热激1h时诱发的删除频率最高，去除选择标记基因的种子达60.36％。后一方式是将未成熟胚接种到萌发培养基上培养，然后在不同时间进行热激处理，以离体培养24h时热激(42℃)1h的去选择标记基因的频率最高，达到50％。 同已报道工作相比较，本工作为提高单子叶转基因植物生物安全性提供了有竞争力的技术体系。 去除选择标记基因的转AtNHX1基因玉米的耐盐性分析拟南芥液泡膜Na+/H+反向转运蛋白(AtNHX1)在拟南芥耐盐中起有重要作用。本工作将AtNHX1基因导入到玉米植株中，以FLP/frt位点特异性重组系统去除选择标记基因als，得到了耐盐性明显提高而无选择标记基因的转基因玉米。Southern杂交表明外源基因已经整合到玉米基因组中并在后代稳定遗传。RT-PCR结果表明外源基因在玉米中能够稳定表达。转AtNHX1基因玉米，无论是在盐胁迫处理前还是在盐胁迫处理过程中，转基因植株均具有比未转基因对照植株显著提高的液泡膜Na+/H+交换活性，而且在盐处理过程中转基因植株有更高的Na+吸收速率，这说明AtNHX1基因的表达促进了转基因植株中Na+向液泡中的区隔化分布，从而避免了细胞质中过量Na+对细胞的伤害。在胁迫处理中转基因植株的Na+含量要高于未转基因对照植株的，差异达到显著或极显著程度。与此同时，与未转基因对照相比，转AtNHX1基因植株的叶片和根中积累了更多的Cl-和K+。这样，转基因植株通过无机离子的大量积累维持较低的细胞溶质势，在盐胁迫下能够较好的保持水分和维持细胞膨压，免受或减轻了盐胁迫造成的伤害。在盐胁迫处理下转基因株系与未转基因株系相比具有了更高的种子萌发率和更多的生物量，转基因植株具备了较好的耐盐性。本工作为我国玉米育种创造出了优异的新材料。 转TsVP基因玉米株系的抗旱性分析本工作通过农杆菌介导法将来自盐芥的编码H+-PPase的基因TsVP导入玉米骨干自交系鲁原92和掖478中，获得了转基因植株。分子鉴定表明外源基因已经整合到玉米基因组中，且其表达强度在不同株系中有差异。通过对转基因植株后代苗期和开花期的抗旱性分析，肯定了转基因玉米的抗旱性有了明显的提高。 在干旱胁迫条件下，转基因TsVP的表达促进了转基因玉米根系的生长，显著增加了转基因植株的生物量和根冠比。如转基因株系L1在干旱胁迫处理后，其地上部分和地下部分及其根冠比分别比经历同样处理的未转基因对照株系高31.6％、76.4％和36.4％。发达的根系有利于植物对水分的吸收，尤其是在土壤含水量较低的情况下。较发达的根系可能是转基因植株抗旱性提高的形态学基础。苗期抗渗透胁迫检测结果表明，转TsVP基因玉米植株的抗渗透胁迫能力与其H+-PPase酶活性呈正相关。胁迫条件下，转基因株系具有较高的种子萌发率，叶片能够保持相对较高的水分含量，细胞膜损伤和膜脂过氧化程度较轻，细胞中积累了更多的可溶性糖和脯氨酸，维持了较低的溶质势。即TsVP基因的转入使得转基因玉米苗期的抗渗透胁迫能力得到明显的提高，其可能的原因是：1、植株有较发达的根系，有利于干旱条件下的水分吸收；2、干旱胁迫下转基因植株通过积累大量的有机溶质，维持了较低的溶质势，有利于细胞保持水分，免受干旱胁迫的伤害。玉米生殖生长期的抗旱性对于产量是至关重要的。对10叶期的大田玉米进行了为期6周的干旱胁迫处理，在胁迫处理的0、1、5、10和14天时取材测定细胞膜离子渗漏率和丙二醛含量、叶片相对含水量及可溶性总糖、脯氨酸含量等。结果与苗期进行的渗透胁迫实验结果相符合，即在胁迫处理过程中转基因植株细胞内合成了更多的可溶性物质，使叶片保持较高的相对含水量，降低了细胞膜损伤程度。同时，转基因植株的雌雄穗开花间隔天数ASI(anthesis-silking interval)少于未转基因对照植株的，差异显著。经历干旱处理后，转基因株系的穗重和粒重明显高于对照株系的，差异达到显著或极显著程度。其中株系L1和L4的千粒重分别比对照株系多27.6％和23.0％；Y1和Y4的则分别比对照株系多15.4％和19.0％。这些结果表明，TsVP基因的转入可明显提高玉米植株生殖生长期的抗旱能力。 本工作首次将来自盐芥的编码H+-PPase的TsVP基因转入玉米，通过转基因植株后代的抗旱性分析肯定了H+-PPase在玉米抗旱机制中有重要作用，并且获得了干旱胁迫后产量明显高于未转基因对照植株的转基因玉米，为培育抗旱玉米新品种创造出了优异材料。 综上所述，本工作得到了适合于单子叶植物高效精确去除选择标记基因的位点特异性重组系统，并在转基因玉米中得到成功的应用，为玉米多基因定点导入和转基因聚合育种打下了基础，也为下一步在其它单子叶转基因作物中应用该系统奠定了必要的基础。同时培育出无选择标记基因的耐盐抗旱玉米新材料，有望为我国粮食安全做出贡献。

目录

论文说明：符号说明

声明

第一章前言

1.1提高转基因植物安全性的策略和研究进展

1.1.1不使用选择标记基因

1.1.2抗性选择标记基因的替换

1.1.3选择标记基因的删除

1.1.4 FLP/frt位点特异性重组系统的研究进展

1.2耐盐抗旱育种的意义和研究现状

1.2.1植物耐盐、抗旱的分子机制

1.2.2液泡膜Na+/H+反向转运蛋白的研究进展

1.2.3液泡膜H+-PPase的研究进展

1.3本工作的目的与意义

第二章适合于单子叶植物位点特异性重组系统的构建

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2质粒的重组和转化

2.2结果与分析

2.2.1含有FLP重组酶基因的单子叶植物表达载体的构建

2.2.2含有FLP重组酶基因的植物表达载体的鉴定

2.2.3含有frt位点的植物表达载体的构建

2.2.4含有热诱导启动子的FLP重组酶的植物表达载体的构建

2.3讨论

第三章FLP/frt系统在玉米中的应用及提高删除效率的研究

3.1材料与方法

3.1.1农杆菌介导的玉米芽尖的遗传转化

3.1.2转基因植株的分子生物学检测

3.1.3转基因植株后代的分析

3.2结果与分析

3.2.1转基因玉米的获得及分子生物学检测

3.2.3转基因植株选择标记基因als的删除和鉴定

3.2.4转基因植株有性杂交后代的删除效率

3.2.5 FLP重组酶基因的遗传稳定性

3.2.6热诱导启动子启动FLP重组酶基因表达对植株选择标记基因删除的影响

3.3讨论

第四章去除选择标记的转AtNHX1的耐盐玉米新材料创造

4.1材料与方法

4.1.1植物材料

4.1.2种子萌发率和植株成活率的测定

4.1.3植株生物量和离子含量的测定

4.1.4玉米植株的培养及苗期的盐胁迫处理

4.1.5 Na+吸收速率的测定

4.1.6 Na+/H+反向转运蛋白的Na+/H+交换活性的测定

4.1.7盐胁迫下AtNHX1基因表达强度的检测

4.2结果与分析

4.2.1盐胁迫对萌发率和存活率的影响

4.2.2盐处理条件下玉米生物量的变化

4.2.3玉米叶片和根的Na+、Cl-和K+离子含量的变化

4.2.4转基因玉米叶片有较快的Na+吸收速率

4.2.5转基因玉米有较高的Na+/H+交换活性

4.3讨论

第五章转TsVP抗旱玉米株系的产生

5.1材料与方法

5.1.1植物材料

5.1.2菌株和质粒

5.1.3农杆菌介导的玉米芽尖的遗传转化

5.1.4转基因植株的获得及其分子生物学检测

5.1.5种子的萌发和幼苗渗透胁迫处理

5.1.6幼根液泡膜的分离及V-H+-ATPase和VH+-PPase活性的测定

5.1.7渗透胁迫下TsVP基因表达强度的检测

5.1.8叶片细胞膜离子渗漏的测定

5.1.9丙二醛的测定

5.1.10叶片相对含水量的测定

5.1.11渗透势、可溶性总糖和脯氨酸的测定

5.1.12干旱胁迫条件下玉米根系观察及生物量测定

5.1.13大田玉米开花期前后的干旱胁迫处理

5.2结果与分析

5.2.1 T2代转乃VP基因玉米的分子生物学检测

5.2.2渗透胁迫对种子萌发的影响

5.2.3渗透胁迫下VH+-ATPase和V-旷-PPase活性及TsVP表达强度的变化

5.2.4渗透胁迫对玉米幼苗细胞膜的损伤

5.2.5叶片细胞溶质势和相对含水量的变化

5.2.6细胞可溶性总糖和脯氨酸含量的变化

5.2.7干旱胁迫下玉米幼苗形态及生物量

5.2.8开花期前后干旱胁迫处理对转TsVP基因玉米各项生理指标的影响

5.2.9干旱胁迫对玉米雌雄穗的生长发育及产量的影响

5.3讨论

第六章总结与展望

参考文献

致谢

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发表论文二