乙型肝炎病毒S蛋白上调干扰素信号通路负性调控分子hPIAS1的作用机制研究

摘要

PIAS1蛋白（protein inhibitor of activated STAT1），又称鸟苷RNA解旋酶II结合蛋白，属于哺乳动物PIAS超家族成员，后者因与STAT转录因子家族之间相互作用而得名。早期研究发现，PIAS1作为 PIAS超家族的一员，其拥有家族共有的RING保守结构域，发挥SUMO（small ubiquitin-related modifier）E3连接酶的作用，参与细胞增殖、分化，DNA损伤及炎症反应等多种细胞活动。而其SAP及C末端结构域则分别与病毒诱导的早期信号传递及干扰素下游信号放大过程有关。沉默/敲除PIAS1分子将增加干扰素诱导基因的表达与机体抗感染能力。近期研究发现，丙型肝炎（HCV）干扰素治疗不应答患者肝组织样本中肝细胞核内 PIAS1分子（hPIAS1）较干扰素治疗应答患者及健康对照表达明显增加。虽然乙型肝炎病毒（HBV）的致病机理与HCV不尽相同，但研究发现其拥有共同的炎症信号通路及相关分子。
　　作为经典的嗜肝病毒之一，持续HBV病毒感染可进展为肝硬化、肝癌等终末期肝病。现有的治疗慢性乙型肝炎（CHB）临床药物主要包括核苷（酸）类似物及a-干扰素，而后者在给药者中的应答率也仅20-30％。药物治疗疗效欠佳的潜在机制正有待进一步研究证实。有研究发现，干扰素治疗应答率与HBV病毒载量相关，且CHB患者干扰素应答不良及T细胞活化失能与高HBV病毒感染有关。患者出现干扰素抗性的分子机制部分可能系肝炎病毒蛋白通过诱导炎症调控分子，从而下调干扰素信号传导通路。基于前期临床数据，我们观察到CHB患者PegIFNa-2a治疗应答与不应答两组间在肝细胞及外周血单个核细胞中hPIAS1分子表达水平存在差异。故我们推断HBV病毒蛋白可能诱导hPIAS1分子在肝脏中高表达，这可能是干扰素治疗失败的众多原因之一。
　　为研究HBV编码病毒蛋白是否能上调hPIAS1分子表达及探讨相关的分子机制，我们进行如下系列实验：首先，我们构建了hPIAS1荧光素酶报告基因质粒hpias1p(-1300)LUC，并在CHO及HepG2细胞系中分别与HBV病毒蛋白表达质粒pcDNA-HBs、cDNA-HBx及pcDNA-HBc，或pcDNA3.1对照空载共转染，同时转染β-Gal作为检测内参，检测相对荧光素酶活性。研究发现，在CHO及HepG2细胞中共转染pcDNA-HBs组的荧光素酶活性相对pcDNA3.1组荧光素酶活性分别增加2.9及3.6倍，差异有统计学意义。同时，在HepG2细胞中分别转染pcDNA-HBs、cDNA-HBx、pcDNA-HBc或pcDNA3.1，进行qRT-PCR及western blot检测发现pcDNA-HBs组hPIAS1的mRNA及蛋白表达均明显高于空载组。通过上述研究表明，HBs蛋白能够通过在转录水平上调肝细胞中hPIAS1基因的表达。其次，我们以hpias1p(-1300)LUC质粒为模板，构建系列5’端缺失的启动子荧光素酶报告基因质粒。研究发现，共转染HBs表达质粒后hPIAS1启动子-507至-712区段（相对转录起始位点）荧光素酶活性显著增强，该区可能与hPIAS1基因转录相关。运用生物信息学方法分析我们认为，TAL1:E47、Kid3、C/EBP gamma、MYOG/NFI及NFI分别为该区5个候选的可能顺式作用元件。分别对hpias1p(-712)LUC进行候选顺式作用元件区定点突变，实验发现CHO细胞及HepG2细胞分别共转染TAL1:E47、C/EBP gamma、MYOG/NFI或 NFI突变质粒的荧光素酶活性较野生型质粒明显减弱。凝胶迁移试验（EMSA）及染色质免疫共沉淀试验（CHIP）进一步在体外及细胞内证实HBs蛋白存在时，反式作用因子TAL1、E47、MYOG及NFI能特异性地与hPIAS1启动子顺式作用元件结合。激光共聚焦试验同时也验证了HepG2细胞转染HBs后，较转染pcDNA3.1组，其转录因子TAL1、E47、MYOG及NFI在细胞内表达明显增加，并出现核内转移。反之，当我们运用siRNA干扰TAL1、E47、MYOG及NFI的表达，发现共转染HBs蛋白后hPIAS1启动子荧光素酶活性较未干扰组分别降低到64.3%,58.0%,59.9%and63.1%，而非相关对照组较之无明显变化。上述实验表明共转录因子TAL1、E47、MYOG及NFI是参与HBs蛋白上调hPIAS1基因的重要分子。进一步研究发现，在转染pcDNA-HBs的HepG2细胞中炎症相关信号通路ERK和p38MAPK磷酸化水平明显升高，总蛋白中转录因子TAL1、E47、MYOG和NFI的表达及hPIAS1蛋白表达水平与P-ERK和P-p38MAPK表达水平呈时间正相关，均在转染后36-48小时达到峰值；核浆蛋白分离实验亦显示，转染pcDNA-HBs的HepG2细胞，转染后48小时TAL1、E47、MYOG和NFI核内表达明显增多，发生核转位。基于上述实验结果，我们进一步运用ERK及p38MAPK信号通路抑制剂PD098059和SB203580，发现分别使用ERK及p38MAPK通路抑制剂后的HepG2细胞pcDNA-HBs转染组，其总蛋白TAL1、E47、MYOG和NFI表达及hPIAS1的表达均不同程度减弱，且TAL1、E47、MYOG和NFI的核转位亦减少，而使用JNK信号通路抑制剂SP600125与未使用抑制剂的pcDNA-HBs转染组上述转录因子表达无明显变化。总之，上述实验结果共同说明HBs病毒蛋白通过活化ERK及p38MAPK信号通路，增加转录因子TAL1、E47、MYOG和 NFI的表达并结合特定的顺式作用元件区，激活hPIAS1基因启动子，从而上调hPIAS1基因的表达。
　　对于HBV感染者，提取外周血单个核细胞（PBMCs）进行western blot试验，发现高HBV感染者，其ERK及p38MAPK信号通路磷酸化水平高于HBV检测不到及健康对照者，其中P-ERK表达水平组间差异有统计学意义；同时结合激光共聚焦试验，我们发现高HBV感染者其转录因子TAL1、E47、MYOG和 NFI的表达亦高于HBV检测不到者或健康对照。在对CHB患者的肝穿组织标本进行免疫组化检测，我们发现，高HBV的CHB患者肝细胞核内hPIAS1分子表达水平较HBV载量低的CHB患者或健康对照明显增高。这些实验共同提示，高水平HBV感染患者体内ERK及p38MAPK信号通路被激活，转录因子TAL1、E47、MYOG和NFI的表达增加，并且肝细胞核内hPIAS1分子的表达也明显增加。
　　综合上述研究，我们发现HBs病毒蛋白能上调hPIAS1基因的表达，其主要是通过活化ERK及p38MAPK信号通路，促进转录因子TAL1、E47、MYOG和NFI的表达及核转位实现。本研究在分子水平上探讨了HBV相关的干扰素信号通路负调控分子hPIAS1基因转录激活机制，有助于揭示CHB抗病毒治疗中病毒与宿主间相互作用的复杂分子网络调控，从而为寻找优化CHB抗病毒治疗的疗效及潜在的分子干预靶标提供理论和实验依据。

目录

声明

第一部分 乙肝病毒编码蛋白对干扰素信号通路负调控分子hPIAS1的上调作用研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 HBs蛋白作用下参与hPIAS1基因转录激活作用的顺式作用元件及反式作用因子研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 HBs蛋白作用下参与活化转录因子TAL1、E47、MYOG及NFI的上游信号通路研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第四部分 MAPKs信号转导途径及相关转录因子TAL1、E47、MYOG和NFI在HBV感染者中的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

主要缩略词中英文对照表

综述:干扰素相关信号网络在病毒性肝炎中的作用

攻读博士学位期间已发表和拟发表论文

致谢